两种硫脂酶对重组菌游离脂肪酸合成能力的影响

侯艳玢，闫依狄，孟鑫

（锦州医科大学食品科学与工程学院，辽宁锦州 121000）

脂肪酸作为一种重要的化合物，广泛应用于食品、医药、保健品等诸多方面，目前主要以动、植物油脂为原料生产[1]，但存在油脂产量低、生产成本高等缺陷，限制了大规模工业化生产。近年来，已有多种微生物用于功能油脂的生产[2-4]。然而，微生物细胞内总脂需采用传统破壁、离心工艺获得，若脂肪酸能以游离形式分泌到细胞外，可减少复杂的分离工艺。已有报道在E. coli中表达植物或内源硫脂酶基因，可获得游离脂肪酸[5-7]。植物硫脂酶基因（Thioesterase，PtFATB）可催化水解脂酰基ACP，生成游离脂肪酸和ACP，解除由脂酰基ACP导致的脂肪酸生物合成调节机制中的反馈抑制作用，释放游离脂肪酸[8]。E.coli硫酯酶（Thioesterase I，tesA）是水解长链脂酰辅酶A（C12～C18）形成游离脂肪酸的关键酶[9-10]。本研究在E. coli中分别表达植物来源和内源的硫脂酶基因，将细胞内形成的脂肪酸以游离形式分泌到细胞外，获得产游离脂肪酸的工程菌。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

E. coli K-12、pET30、E. coli BL21（DE3）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）组培苗由本实验室提供；Taq DNA polymerase，T4 DNA连接酶购自Takara公司；反转录试剂盒Revert Aid First strand cDNA Synthesis Kit，胶回收试剂盒购自Fermentas公司；PCR引物由上海生工公司合成；游离脂肪酸测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；其他试剂为国产分析纯。MyCycler Thermal Cycler PCR仪、电泳仪和凝胶成像系统为美国BIO-RAD公司生产，Agilent 6897气相色谱由Agilent公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及培养条件

将-80 ℃甘油保存的E. coli K-12接种于LB液体培养基中[2]，37 ℃振荡培养过夜，用于提取基因组DNA。

1.2.2 硫脂酶PtFATB基因的表达

用总RNA提取试剂盒提取拟南芥总RNA，并经Revert Aid First strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成cDNA。以拟南芥cDNA为模板扩增PtFATB基因序列，th-L：CATGCCATGGTTTTGAAGCTTTC GTGTAATGTGAC；th-R：CGCGGATCCTTAACTTG AAGGCTTCTTTCTCCAC。PCR扩增条件：94 ℃预变性 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环。PCR产物与pET30a(+)分别用NcoI/BamHI酶切，构建表达载体pET-PtFATB，并转化至BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌MX1。

1.2.3 硫脂酶tesA基因的表达

以E. coli K-12 DNA为模板扩增tesA基因序列，tesA-L：CCGGAATTCATGAACTTCAACAATGTTTTCC，tesA-R：ACGCGTCGACTTATGAGTCATGATTTACTAAAGGC。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，35个循环。反应产物和pET30a(+)分别经NcoI/SalI酶切，构建表达载体pET-tesA，并转化至BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌MX22。

1.2.4 重组酶的诱导表达

将重组菌MX1、MX2分别接种至含50 mL 50 μg/mL Kan的LB液体培养液中，30 ℃诱导表达8～12 h，超声波破壁后进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。将重组菌MX1和MX22分别接种在M9基本培养基中，30 ℃诱导12 h后测定代谢产物。总脂含量用游离脂肪酸试剂盒测定，葡萄糖含量用生物传感仪测定。

2 结果与分析

2.1 硫酯酶基因的扩增和表达

重组质粒pMX1和pMX22分别经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，目的片段成功插入到表达载体的相应位点上，获得阳性重组菌MX1和MX22（图1和图2所示）。

如图3所示，SDS-PAGE电泳表明，两种硫酯酶基因在E. coli中成功表达，均可见清晰的条带，tesA基因表达产物约为28.9 KD，PtFATB基因表达产物约为45 KD，与预期结果一致，表明两种硫酯酶基因已成功在E. coli中表达。

图1 拟南芥硫脂酶基因的PCR扩增和重组质粒构建

图2 大肠杆菌硫脂酶基因的PCR扩增和重组质粒构建

图3 不同来源的硫脂酶基因在大肠杆菌中的表达

2.2 硫脂酶基因功能比较

在E. coli中表达PtFATB和tesA后，获得的胞外游离脂肪酸为33.53 mg/L和25.23 mg/L，为原始菌株的5～6倍，胞外游离脂肪酸与胞内总脂比例为1∶5.8和1∶7.2，游离脂肪酸含量约占总脂的14.71%和12.13%。在天然E. coli中，脂肪酸合成与磷脂合成是紧密相联的过程，细胞内脂肪酸合成的中间产物非常有限，脂酰ACP的大量积累会抑制脂肪酸合成。在硫脂酶水解作用下，可有效解除细胞内的底物抑制现象，E. coli细胞内形成的脂肪酸在硫脂酶水解作用下，释放出游离脂肪酸。两种硫脂酶基因功能验证如表1所示。

表1 两种硫脂酶基因功能验证

3 结论

在E. coli中分别表达了拟南芥和内源硫脂酶基因，两者均能提高重组菌细胞内不饱和脂肪酸水平，解除产物的反馈抑制作用，脂肪酸以游离形式分泌到外，胞外游离脂肪酸和胞内总脂比例分别为1∶5.8和1∶7，占细胞总脂的14.7%和12.1%。