粪大肠菌群检测方法探究

潘均悦

（山西省地质矿产研究院，山西太原 030001）

粪大肠菌群是大肠菌群的一种，具体可以分为4类，分别是肠杆菌属、大肠埃希氏菌属、枸橼酸菌属和克雷伯菌属。粪大肠菌群属于革兰氏阴性无芽孢杆菌，是好氧、兼性厌氧菌，能够发酵，分解乳糖产生酸和二氧化碳等气体[1]。除了在人体中可以检测到，粪大肠菌还可在排泄物中检测出来。但有研究者从各地的水体中也检测出来有此菌群，说明即使在不是粪便污染的情况下，也有可能在水体中检测到该菌群。如果水流上游甚至下游被粪便污染，水流动中可能将整个水体污染，从而引发肠道病原菌感染及相关疾病。而粪大肠菌群检测就是反应粪便对水体污染情况的检测手段。因此，通过粪大肠菌群检测，对监测水源处粪大肠菌群的污染状况，从而进行有效、及时、可靠的预测以及对流行疾病及时的控制与传播有着重要意义。

1 粪大肠菌群检测方法

1.1 发酵法

1.1.1 原理

大肠菌群可分解乳糖，产酸产气，使多管发酵过程中乳糖蛋白胨培养基逐渐变为黄色，且有气泡产生。

1.1.2 检测步骤

粪大肠菌群可以通过乳糖蛋白胨多管发酵，具体实验培养流程有如下5个步骤[2]。

（1）无菌实验，即经过灭菌消毒等过程，保证实验环境无菌；对照试验，即保证其他无关因素相同，与实验组形成对照。

（2）提前准备水样本，设置5组实验组，按照水样的污染程度确定接种量，一般选取10.00 mL、1.00 mL、0.10 mL、0.01 mL等。

（3）制备3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液或一般浓度乳糖蛋白胨培养液，若接种体积为10 mL，则使用3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液；若接种体积为1 mL或小于1 mL，则使用一般浓度培养液。

（4）进行初发酵实验，首先将检测水样进行搅拌混合均匀，然后接种到装有培养液的试管中，同时要保证储存试管和5份培养液都是已灭菌无杂质的状态。在（37.5±0.5）℃条件下培养（24±2）h。若产酸产气，则说明该试管为阳性。

（5）进行复发酵实验，轻微振荡初发酵实验中呈阳性的试管，在温度为（44.5±0.5）℃的恒温条件下放置培养（24±2）h。在发酵过程中，由于水样中菌群种类可能不只是目标菌群，培养基中可能会生长出其他种类菌落。为了保证目标菌群的纯度，需要将其他菌落提取出来，置于EC肉汤培养基中培养，要求在温度（44.5±0.5）℃的条件下培养（24±2）h并进行观测。观测过程中，如果有阳性产气现象，则证明有大肠菌群生长。发酵过程中，利用最大可能数MPN值和MPN指数的关系进行计算。

乳糖蛋白胨多管发酵法是至今为止我国最常使用的粪大肠菌群检测方法，也在各个国家中广泛使用。各界研究人员对此检测方法的认识达成了一致，因此乳糖蛋白胨多管发酵法属于国际标准方法。这种检测方法的优点：操作起来所需成本如财力物力人力较低，对操控的技术要求不高，在技术方面的花费相对较少，同时还能够得到相对准确的结果。缺点：在实际操作方面步骤繁琐条件过多，在实验得出结论时不能马上使用，需要开展验证试验，验证结果是否准确，但检测的准确性和可靠程度很容易受到外部环境的影响，如实验人员数量、样品量、实验容器的无菌状况等；同时，检测所需时间也很长。

多管发酵法的实验开展需要庞大的实验团队才能完成，但一般基层机构的实验能力无法满足。在研究人员对实验方法的不断改进下，多管发酵法发展为五管法、十管法和十五管法等。以十五管法为例，其具体步骤如下：（1）样品采集，通过肉眼观察清澈水体，一般为自然流水、城市流动河水和排放污水；（2）样品稀释和接种，当接种量小于1 mL时，应对样品进行10倍或100倍的稀释。无菌条件下，在5支装有3倍乳糖蛋白胨培养基的试管中各接种样品10 mL，在10支装有单倍乳糖蛋白胨培养基的试管中，5支接种样品1 mL，5支接种样品0.1 mL；（3）将接种后的试管在（37±0.5）℃下培养（24±2）h进行初发酵实验，选择产酸产气的阳性试管进行复发酵实验，在（44.5±0.5）℃下培养（24±2）h后进行对照观察及计算。

1.2 滤膜法

1.2.1 原理

提前对实验仪器及实验环境进行灭菌处理，在过滤器中放入微孔滤膜，将水样缓慢倒入过滤器中，应用抽滤法进行过滤。抽滤过后，菌种将会过滤吸附在滤膜表面。制备粪大肠杆菌培养基（MFC选择性培养基），并将滤膜贴合在培养基表面进行接种，保持环境温度为（44.5±0.5）℃恒温，进行培养观察。待培养基上长出粪大肠菌群后，观察是否符合菌群特征，然后进行数量统计，并计算平均每升水样中粪大肠菌群的数量。

1.2.2 检测方法

（1）过滤检测水样，使用无杂质无菌的工具镊起灭菌滤膜的边缘，将细腻的一面放在下面，在过滤器中贴合滤床，并进行灭菌，加入10 mL无菌清澈水样，再用已灭菌无杂质的吸管提取混匀均匀的待检测水样，打开过滤器阀门，在负压50 kPa下进行抽滤。

（2）培养细菌，水样滤完后，继续抽出实验仪器中的气体5 s，并关闭过滤器的阀门。对操作工具进行灭菌，将过滤器下置，带菌滤膜放置到MFC培养基表面，进行接种。注意在接种时要将滤膜吸附菌种的一面朝上，且滤膜应当紧贴培养基，以避免菌种无法正常生长。培养操作完成后，将培养皿密封倒置于培养箱中，保持（44.5±0.5）℃恒温环境，培养（24±2）h。

（3）统计数据并报告结果，对菌落数量进行观察计数。因为粪大肠杆菌菌落为蓝色或蓝绿色，很容易和其他菌落颜色区别开来；且在培养环境温度下，其他菌落或与培养基试剂反应，或不易生长，所以MFC培养基上大部分是粪大肠菌群菌落。如有疑似菌种，则可将疑似菌落滴入EC培养液，保持（44.5±0.5）℃恒温，并培养观测（24±2）h。统计颜色为蓝色或蓝绿色的粪大肠菌群菌落，根据体积和浓度关系，通过公式1计算得出每升水样中粪大肠菌群菌落的数量。

其中，菌群菌落数目单位为个/L，过滤水样量单位为mL。

1.3 纸片快速检测法

1.3.1 原理

实验所采用的滤纸吸收选择性的培养基，需要将滤纸与培养基贴合，在特定温度下培养24 h。细菌繁殖会产生酸，可使溴甲酚紫指示剂变为黄色，且脱氢酶会将底物还原成三苯甲臜，显红色，故观察到的现象为黄色背景下出现红色斑点。通过以上现象便可判断样品中大肠菌群存在与否及浓度。

1.3.2 检测方法

纸片快速检测法和发酵法的实验相似：（1）取10 mL水样接种，需要选取接种所用的5张纸片，规格为15 cm×l0 cm；（2）取1 mL水样接种，需要选取接种所用的10张纸片，规格为5 cm×6 cm，用5张纸片进行常规接种，另外5张纸片接种检测水样10倍稀释液各1 mL；（3）在恒温（44.5±0.5）℃的环境下放置18～24 h，观察并统计菌落数，统计纸片阳性情况，并与MPN值表进行比较。其中，阴性阳性判断准则如下：菌落颜色为紫红色，外部伴有黄色圆圈，则为阳性；菌落形状为片状，颜色为红色，外部伴有黄色圆圈，则为阴性。

1.4 酶底物法

1.4.1 原理

大肠菌群菌落能够产生半乳糖苷酶，从而分解乳糖，使培养基有菌部分变为黄色；而大肠埃希氏菌葡萄糖醛酸酶，可以分解葡萄糖，产生的物质可在366 nm波长处进行紫外检测，观测显示荧光现象，从而可以定量统计出粪大肠菌群数[3-4]。

1.4.2 检测方法

（1）酶底物检测法选用51孔的定量盘法，定量盘法是一种以MPN为基础的方法。（2）检测水样容量为100 mL，先使用100 mL无菌无杂质的量瓶量取出100 mL测试水样，并在水样中加入一定量的MMO－MUG粉末，搅拌均匀。（3）准备容量为5 L的无菌定量盘，将制备好的水样溶液倒入其中。（4）用工具消除定量盘内的气泡，并进行密封操作。（5）在培养箱内设置（44.5±0.5）℃的恒温环境，并进行观测，培养（24±2）h，若检测水样变黄，则说明大肠菌群菌落的存在。

2 不同检测方法的检测效果对比

如表1所示，为粪大肠菌群各检测方法的比较。由表1可知，发酵法和滤膜法实验步骤多、干扰多、可行度不够高，且实验周期比较长，实际应用不太方便。纸片快速检测法与发酵法相比，只需要保持温度（44.5±0.5）℃，时间在18～24 h就可得出结果，检测较快捷，通常用在需要快速出结果的检测任务中。酶底物法操作简单，用时短，只需要进行一次实验就可满足检测要求，但花费较高[5]。

表1 粪大肠菌群各检测方法比较

3 结语

我国科学技术和生物化学检测技术在不断进步，粪大肠菌群的检测方式也更加多样，用时更短，可信度和实验效率更高。目前比较通用的方法有发酵法、酶底物法、滤膜法等，各种检测方法都有其存在合理性，通过今后不懈的努力，会研究出更多、更实用的检测方法，如进一步缩减检测的花费成本、缩减检测等待的时间、加强检验效率和结果可信度等，并赋予粪大肠菌群检测更多的使用价值。