超声-纤维素酶协同提取万年蒿总黄酮工艺及其抗氧化研究

尚东惠，党永康，梁凯洁，杨敏

（吉林农业科技学院，吉林吉林 132001）

万年篙是朝鲜族的民间常用药材，别名白莲蒿、铁杆蒿，具有抗氧化、清热解毒、保肝利胆、抗菌、抗肿瘤等生物活性[1-2]。万年蒿可作为陈茵蒿的替代品，东北某些地区在治疗黄疸等肝炎症状时，更愿意选用万年蒿替代陈茵蒿作为首选药物。适量外用可治疗创伤出血，也可做饲料，药用部位一般为其地上部分，也可为全草[3]。因此，对万年蒿的研究和应用具有极其重要的社会意义和药用价值[4]。

黄酮类化合物是万年蒿发挥药理学作用的主要有效成分。据文献报道，纤维素酶可以提高药材有效成分的溶出率[4]。本实验在优化万年蒿总黄酮超声提取工艺的基础上，添加纤维素酶并采用单因素实验筛选出最佳的提取方法[5]，根据单因素的试验结果，采用正交试验设计对筛选出的提取方法进行优化，并对其进行清除DPPH自由基（二苯代苦味阱自由基）和还原能力的研究，为万年蒿的研究和开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

纤维素酶（＞30 000 U/g）、95%乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、甲醇、无水乙醇、DPPH溶液、磷酸缓冲溶液、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸等均为分析纯，购自上海国药试剂有限公司，芦丁购自北京化学试剂公司。

QCD6150型超声提取器，天津恒瑞机电设备有限公司；TU-1221型紫外可见分光光度计，北京普析有限责任公司；恒温水浴锅，国华电器有限公司；TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器厂；BS224S型电子天平，德国赛多利斯。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮标准曲线的建立

采用文献[6]中报道的方法，取0.20 mg/mL的芦丁对照品，用30%的乙醇溶解定容，配制成浓度为0 mg/mL、0.08 mg/mL、0.16 mg/mL、0.24 mg/mL、0.40 mg/mL的一系列标准溶液；加入5% NaNO2溶液和10% Al(NO3)3溶液，摇匀静置后加入4%的NaOH溶液，用紫外分光光度计在波长为510 nm处测量吸光度，并绘制标准曲线。

1.2.2 超声-纤维素酶协同法提取总黄酮及含量测定

称取适当的纤维素酶，加入pH 4.5醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH进行活化，置于烧杯中，再添加万年蒿粗粉1.0 g，在一定温度的恒温水浴锅中酶解一定时间后灭酶。按一定的料液比（g∶mL）加入不同体积分数的乙醇溶液，密封，转移至设定好参数的超声波中进行超声波提取，得到的提取液进行抽滤，2 000 r/min离心6 min，取上清液作为提取液的最终测定样本，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定万年蒿总黄酮吸光度A，将测定的万年蒿总黄酮的吸光度A代入标准曲线方程中求出提取液中的总黄酮浓度C，按式1计算得率[7]。

式中，V为测定液的体积，mL；C为万年蒿总黄酮测定样品液浓度，mg/mL；X为万年蒿总黄酮提取液稀释总倍数；W为每次提取加入的万年蒿质量，g。

改变超声波功率（400 W、500 W、600 W、700 W和 800 W）、超声时间（30 min、40 min、50 min、60 min和70 min、）、乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%和90%）及料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50）进行单因素试验，得出每个因素最佳水平进行正交试验优化。

1.2.3 正交试验设计

以黄酮得率为考察指标，通过正交试验确定最佳条件。如表1所示，选取超声波功率、乙醇体积分数、超声波时间及料液比作为主要考察因素，按照L9（34）进行试验设计。

表1 试验因素水平表

1.2.4 万年蒿总黄酮抗氧化活性研究

选取DPPH与黄酮类提取物进行显色反应，通过显色的结果确定所提取黄酮类物质的抗氧化活性。准确称取一定量万年蒿总黄酮粉末，分别加入甲醇配制成样品溶液。称取DPPH溶解于无水乙醇中，摇匀避光保存。分别取1 mL待测样液和3 mL DPPH溶液混合摇匀，室温避光静置30 min，于517 nm波长下测定吸光度值[8]。根据公式2计算样品自由基清除率K。

式中，K为样品对DPPH的清除率，%；Ai为2 mL DPPH溶液+2 mL样品提取液的吸光度；Aj为2 mL 样品提取液+2 mL乙醇的吸光度；Ac为2 mL DPPH溶液+2 mL乙醇的吸光度。

1.2.5 万年蒿总黄酮的还原力测定研究

取万年蒿中总黄酮样品，配制成不同浓度的样品溶液，各取1 mL加入0.2 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=6.6）2 mL和1%铁氰化钾溶液2 mL，混合物于50 ℃水浴保温20 min，然后加入10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min离心。取上清液2 mL，加入蒸馏水2 mL及0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，混合后于700 nm波长下测吸光度。

2 结果与分析

2.1 黄酮标准曲线

如图1所示，黄酮标准曲线为Y=2.020 4X-0.000 6，R2=0.998 8，其中Y为吸光度值，X为芦丁溶液浓度。

图1 黄酮标准曲线

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 超声波功率对万年蒿总黄酮得率的影响

选定超声波时间为50 min，乙醇体积分数为70%，料液比1∶20（g∶mL），研究不同超声波功率对万年蒿总黄酮得率的影响，结果如图2所示。黄酮得率最大时超声波功率为600 W，所采用超声波功率小于最佳超声波功率时，黄酮得率会随着超声波功率的增大而增加，当超声波功率大于最佳超声波功率时，黄酮得率随着超声波功率的增大而下降。可能由于当超声波功率过高时，黄酮部分降解于溶液中，造成得率降低。

2.2.2 超声时间对万年蒿总黄酮得率的影响

选定超声波功率为600 W，乙醇体积分数为70%，料液比1∶20，研究不同超声时间对万年蒿总黄酮得率的影响，结果如图3所示。黄酮得率最大时，超声时间为50 min，所采用超声时间小于最佳超声时间时，黄酮得率会随着超声时间的增加而提高，当超声时间大于最佳超声时间时，黄酮得率随着超声时间的增加而下降。可能的原因是当超声时间过长时，黄酮会进一步降解，造成得率降低。

图2 超声波功率对万年蒿总黄酮得率的影响

图3 超声时间对万年蒿总黄酮得率的影响

2.2.3 乙醇体积分数对万年蒿总黄酮得率的影响

选定超声波功率为600 W，超声时间为50 min，料液比1∶20，研究不同乙醇体积分数对万年蒿总黄酮得率的影响，结果如图4所示。黄酮得率最大时，乙醇体积分数为70%，所采用乙醇体积分数小于最佳乙醇体积分数时，黄酮得率会随着乙醇体积分数的提高而增加，当乙醇体积分数大于最佳乙醇体积分数时，黄酮得率随着乙醇体积分数的提高而下降。由于乙醇体积分数的进一步增大会将所提取出的有效物质黄酮降解，导致黄酮的得率降低。

2.2.4 料液比对万年蒿总黄酮得率的影响

选定超声波功率为600 W，超声波时间为50 min，乙醇体积分数为70%，研究不同料液比对万年蒿总黄酮得率的影响，结果如图5所示。黄酮得率最大时，料液比为1∶20，料液比过高或过低都会导致黄酮得率下降。

图4 乙醇体积分数对万年蒿总黄酮得率的影响

图5 料液比对万年蒿总黄酮得率的影响

2.3 正交试验结果分析

正交试验结果见表2，方差分析见表3。影响超声-纤维素酶协同提取总黄酮的主要因素是超声波功率，而乙醇体积分数和料液比的影响相对较小。各因素的主次顺序是：超声波功率＞超声时间＞乙醇体积分数＞料液比。最优提取条件为：超声波功率为600 W，超声波时间为50 min，乙醇体积分数为70%，料液比1∶20。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

2.4 抗氧化活性试验

总黄酮的抗氧化活性试验结果见图6。如图6所示，当总黄酮的浓度提高时，体系对DPPH的清除率也逐渐增大。数据表明，试验提取过程中没有对黄酮的抗氧化性造成破坏。

图6 总黄酮提取液的抗氧化活性测试曲线

2.5 还原力的测定试验

总黄酮的还原能力测定结果见图7。如图7所示，当总黄酮的浓度提高时，体系对铁离子的还原能力也逐渐提高。当提取液中总黄铜浓度为1.6 mg/mL时，还原能力开始趋于平稳但还是在逐渐提高。数据表明，超声-纤维素酶协同提取过程中没有对黄酮的还原性造成破坏。

图7 总黄酮提取液的还原能力测试曲线

3 结论

万年蒿中黄酮提取的最佳提取工艺为：纤维素酶用量8 mg/g，超声波功率为600 W，超声波时间为50 min，乙醇体积分数为70%，料液比1∶20（g∶mL）。在此条件下，黄酮得率为3.31 mg/g，且在提取过程中没有对黄酮的抗氧化性和还原性造成破坏。