高效液相色谱法测定不同品系亳白芍中4种化学成分含量

张腾腾，张梦娇，王婉婷，居正，姬雨思，朱蝶

（亳州学院中药学院，安徽亳州 236800）

白芍始载于古籍《神农本草经》中[1]，亦别名为芍药，来源于毛莨科植物芍药（Paeonia lactitlora Pall.）的干燥根，其性苦、酸，微寒，归肝和脾经，是闻名的大宗中药材，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛和平抑肝阳的功效[2]，古籍中曰其“益脾、能与土中泻木”[3]。白芍的有效部位是白芍总苷，包括芍药苷、芍药内酯苷及氧化芍药苷等众多的单萜糖苷类化合物，是白芍的药效物质基础[4]。现代药理表明，白芍总苷具有镇痛、抗炎以及保肝等多种作用[5-6]。李驰[7]在研究亳白芍中化学成分时也提到，其含有的单萜糖苷类化合物有镇痛、抗抑郁和免疫调节等药理作用。

“亳白芍”是4大亳药之一，为安徽省具有代表性的道地药材之一。有学者认为安徽的白芍栽培种质混杂，需要加强对白芍资源的保护和利用，并从中发现优异种质，以利于白芍的生产发展和优良品种的选育[8]。安徽亳州地区主栽白芍有“线条”“线蒲棒”“蒲棒”“马扎子”“二糟”等多个品系，对各个品系中有效成分含量的研究较少。本实验采用高效液相色谱法（HPLC）对上述5个品系白芍的芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷及苯甲酰芍药苷4种有效成分进行测定，为进一步筛选出优良品系、保持亳白芍的道地性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

“线条”“线蒲棒”“蒲棒”“马扎子”“二糟”样品于2019年采集于安徽亳州市大杨镇。

1.2 仪器与试剂

LC-20AD高效液相色谱仪，岛津；FA2104N分析天平，上海菁海仪器有限公司；XS105电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；UH4150紫外可见近红外分光光度计，HITACHI；DFY-400打粉机，温岭市大机械有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，上海江星仪器有限公司；DGT-G电热鼓风干燥箱，合肥华德利科学器材有限公司；JK-200DB超声波清洗仪，合肥金尼克机械制造有限公司。

苯甲酰芍药苷对照品，批号19103002，成都普菲德生物技术有限公司；氧化芍药苷对照品，批号19053107，成都普菲德生物技术有限公司；芍药内酯苷对照品，批号19011503，成都普菲德生物技术有限公司；芍药苷对照品，批号110736-201943，中国食品药品检定研究院。乙腈（国药集团化学试剂有限公司）、甲醇（国药集团化学试剂有限公司），色谱级；磷酸(国药集团化学试剂有限公司)，优级纯；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），分析纯；屈臣氏纯净水。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Waters XBridge C18（0.46 cm×25 cm，5 μm）；流动相A为0.015%磷酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序为：0 min（92% A），5 min（88% A），17.5 min（87% A），20 min（86% A），38 min（80% A），48 min（70% A），63 min（40% A），73 min（92% A）；检测波长258 nm（氧化芍药苷），230 nm（其余3种成分）；柱温30 ℃，流速 0.8 mL/min，进样量 10 μL。

1.3.2 溶液制备

1.3.2.1 对照品溶液的制备

精密称定芍药内酯苷2.36 mg，定容于10 mL容量瓶中；精密称定氧化芍药苷0.27 mg、苯甲酰芍药苷0.46 mg、芍药苷13.12 mg，分别定容于25 mL容量瓶中，加色谱级甲醇定容至刻度线处，摇匀，即得4种对照品贮备液。

1.3.2.2 供试品溶液的制备

称取0.5 g白芍粉末（过80目筛）置于锥形瓶中，移取25 mL 50%乙醇溶液加入上述锥形瓶中，称重，然后置于水浴锅中加热回流25 min后取出冷却，补足减失重量，摇匀，用0.45 μm有机系滤头过滤，取滤液。

1.3.3 方法学考察

1.3.3.1 线性关系考察

分别精密移取氧化芍药苷对照品溶液0.1 mL、0.4 mL、0.7 mL、1.0 mL、1.3 mL，芍药内酯苷对照品溶液0.6 mL、1.1 mL、1.6 mL、2.1 mL、2.6 mL，芍药苷对照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，苯甲酰芍药苷对照品溶液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇（色谱级）定容，摇匀后制成4种混合对照品溶液。在“1.3.1”项色谱条件下，进样。以相应对照品质量X（μg）为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，计算线性回归方程。

1.3.3.2 精密度试验

吸取同一混合对照品溶液10.0 μL，按照“1.3.1”项下色谱条件，连续进样6次，分别计算4种化合物色谱峰峰面积的RSD值。

1.3.3.3 稳定性试验

取同一样品，按照供试品溶液操作方式进行处理。在“1.3.1”项色谱条件下，连续进样12 h，每针间隔3 h，分别计算4种化合物色谱峰峰面积的RSD值。

1.3.3.4 重复性试验

称取同一样品6份，分别按照“1.3.2”条件制成供试品溶液。在“1.3.1”项色谱条件下，分别进样测定，记录并计算4种化合物峰面积的RSD值。

1.3.3.5 加样回收率

取已知含量的亳白芍样品粉末5份，每份约0.25 g，精密称定。按1∶1分别加入4种对照品适量，按“1.3.2”项下的方法制备供试品溶液，按“1.3.1”项下的色谱条件进行测定，记录相应成分的色谱峰面积，计算回收率。

1.3.4 样品含量测定

取“线条”“线蒲棒”“蒲棒”“马扎子”“二糟”5个品系亳白芍，按照“1.3.2”项下制备供试品溶液，按“1.3.1”项下的色谱条件进行测定。

2 结果与分析

2.1 4种有效成分色谱图

白芍混合对照品中4种化学成分的出峰时间基本与亳白芍样品中4种化学成分的出峰时间一致。

图1 混合对照品与亳白芍样品色谱图

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系

在线性关系考察中，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷及苯甲酰芍药苷在其各自的线性范围内，相关系数分别是0.999 3、0.999 8、0.999 0、0.999 9，表明线性关系较好，其线性回归方程如表1所示。

2.2.2 精密度

精密度实验中，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷及苯甲酰芍药苷面积的RSD分别为0.27%、0.32%、0.25%、0.27%，表明精密度良好。

表1 线性关系考察表

2.2.3 稳定性

稳定性实验中，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷及苯甲酰芍药苷面积的RSD分别为0.31%、0.12%、0.10%、0.12%，表明溶液在12 h内稳定。

2.2.4 重复性

重复性实验中，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷及苯甲酰芍药苷峰面积RSD分别为0.59%、0.80%、0.33%、0.12%，表明该法重复性良好。

2.2.5 加样回收率

在加样回收率实验中，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷及苯甲酰芍药苷的平均回收率分别为100.75%、98.67%、98.11%、98.34%，从表2可以看出，该法回收率较好。

2.3 样品含量

如表3所示，为不同品系亳白芍药材中4种成分含量。若以芍药苷含量为考察指标，则5种品系含量由高到低依次为二糟＞线蒲棒＞蒲棒＞马扎子＞线条；若以4种单萜苷总含量为考察指标，则二糟＞线蒲棒＞马扎子＞蒲棒＞线条。

表2 4种单萜苷成分的加样回收率测定

表3 不同品系亳白芍药材中4种成分含量

3 结论

不同品系亳白芍的4种单萜苷含量及总含量各不同，以芍药苷含量和以四种单萜苷总含量为考察指标时，五种品系中芍药苷含量和四种单萜苷的总含量排名进行比较，发现不同品系亳白芍的排名存在部分差异，表明不同品种亳白芍质量存在优劣。