高危孕妇产前诊断胎儿性染色体异常的遗传学分析

肖钧方，刘艳秋，邹永毅，马鹏鹏，周吉会

(江西省妇幼保健院产前诊断中心，南昌 330006)

中国是出生缺陷高发的国家之一， 其中染色体病是导致胎儿严重智力低下及先天畸形的主要原因，且无有效的治疗方法[1,2]。 性染色体异常临床表型多样，严重的会导致胎儿生殖器官发育不全，并可伴其他脏器结构功能异常、智力低下、精神及神经功能障碍，成年后可出现不孕不育，其对个人心理及生理的影响相较其他系统畸形可能更为严重[3,4]。 传统的染色体G 显带核型分析技术是诊断胎儿染色体核型的金标准,但耗时长，分辨率有限。拷贝数异常（copy number variations，CNVs）是指基因组结构一般长度在1kb 以上重复、 缺失的亚显微结构变异[5]。 CNVs 可以通过比较基因组杂交（a CGH）和单核苷酸多态性微阵列(SNP-array)芯片技术进行检测,或者利用全基因组测序(CNV-seq)数据进行计算推断[6]。 荧光原位杂交(FISH，fluorescence in situ hybridization）技术是利用碱基的互补配对将荧光标记的探针与目的DNA 进行杂交，通过荧光显微镜观察并计数， 使用间期细胞时无需培养，诊断周期快速，成功率高，对染色体嵌合诊断价值较高。 无创产前DNA 筛查对胎儿染色体非整倍体疾病21 三体、18 三体及13 三体检出率较高，对检测胎儿性染色体也具有一定价值[7]。 本研究通过运用多种遗传学方法对3591 例高危孕妇进行产前诊断， 总结其中性染色体异常与产前诊断指征之间的相关性， 并分析探讨不同遗传学技术的诊断价值，为产前诊断的临床咨询提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集 2018 年 1 月-2019 年 12 月在因不同产前诊断指征在江西省妇幼保健院产前诊断中心行绒毛、 羊水、 脐血穿刺检查的孕妇3591例。 年龄 17-47 岁，孕周 11-32 周。 根据不同的产前诊断指征分组：高龄组为预产年龄≥35 岁，建议直接行介入性产前诊断； 唐筛异常组为血清筛查21 三体、18 三体高风险；超声异常组为超声提示胎儿软指标异常或结构异常， 如颈部透明层增厚、肾盂增宽、侧脑室增宽等；无创DNA 异常根据检查结果分为无创DNA 高风险组和性染色体异常高风险组；不良孕产史组为死胎、畸胎引产史或生育过出生缺陷儿病史等； 其他原因组为孕早期服用药物史、接触放射线、不良工作环境、夫妇染色体异常或单基因病携带等情况。最后纳入诊断结果为不合并常染色体异常的性染色体异常病例。上述各组之间无交叉情况。 所有孕妇无介入性产前诊断禁忌证，且均签署产前诊断知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 方法 在超声实时引导下，行绒毛穿刺活检术（孕 11-14 周）、羊膜腔穿刺术（孕 18-24 周）、脐静脉穿刺术（孕24 周后）。抽取绒毛、羊水或胎儿脐静脉血标本进行染色体显带技术、FISH 原位杂交，征得孕妇同意后应用全基因组测序拷贝数变异分析（CNV-seq） 或染色体微阵列（CMA）CytoScan750k芯片进行染色体微缺失和微重复的检测。用国际数据 库 包 括 DECIPHER、Database of Genomic Variants (DGV)、Online Mendelian Inherit-ance in Man(OMIM)、UCSC Genome Browser、ENS EMBL 等进行致病性分析，依据 ACMG（American College of Medical Genetics and Genomics） 判 读 指 南 进 行CNVs 致病性的判读。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计数资料用百分率表示，各组间率的比较用χ2检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同产前诊断穿刺指征下的性染色体异常胎儿检出情况 3591 例不同产前诊断指征下的高危孕妇经染色体核型分析、FISH、CMA/CNV-seq 检测共检出性染色体异常胎儿137 例， 性染色体异常检出率约为3.81%。不同产前诊断指征的性染色体异常检出率不相同，无创DNA 组的性染色体异常组检出率在所有组别中最高，为51.85%。详细检出情况见表1。各组间的异常率比较差异具有统计学意义（χ2=1071.319，P＜0.001）, 无创 DNA 性染色体异常组与其他各组比较均存在差异。

表1 不同产前诊断指征组构成比和性染色体异常检出率[n(%)]

2.2 性染色体异常类型分布情况 137 例性染色体异常胎儿中染色体数目异常95 例， 包括45,X 12例，45,X 嵌合体 16 例，47,XXY 28 例，47,XXY 嵌合 2 例 ，47,XXX 12 例 ，47,XXX 嵌 合 1 例 ，48,XXXX 1 例，47,XYY 21 例，47, inv(Y)(p11q11) ,inv(Y)(p11q11) 2 例。 染色体结构异常42 例 包括46,X,psu dic(X)(p11.2) 1 例，46,X,psu idic(Y)(p11.3) 1例，46,X,inv(Y)(p11q11) 12 例，46,X,Yqh- 4 例，46,X,Yqh+ 1 例，46,X,Yqs 1 例，X 染色体片段缺失 6例，X 染色体片段重复 16 例。

2.2.1 45,X 胎儿 12 例 45,X 胎儿中，8 例为超声异常，均为早孕期筛查异常，包括单纯NT 增厚3例、颈部水囊瘤3 例、胎儿全身水肿2 例，4 例为无创DNA 异常。 16 例嵌合体胎儿中，1 例为孕妇高龄，1 例为唐筛18 三体高危，2 例为超声异常，包括NT 增厚1 例、双侧马蹄足内翻1 例，12 例为无创DNA 异常。 详细分布情况见表2。

2.2.2 47,XXY 胎儿 28 例 47,XXY 胎儿中，2 例为超声异常，包括 NT 增厚 1 例、单脐动脉 1 例，26 例为无创DNA 异常。 2 例嵌合体胎儿均为无创DNA异常。

2.2.3 47,XXX 胎儿 12 例 47,XXX 胎儿中，1 例为超声提示鼻骨发育不良和左心室强光点，11 例为无创DNA 提示性染色体异常。 1 例嵌合体胎儿为无创DNA 异常。此外，还有 1 例 48,XXXX 胎儿，为无创DNA 异常。

2.2.4 47,XYY 胎儿 21 例 47,XYY 胎儿中，1 例为唐筛21 三体高危，20 例为无创DNA 异常。 此外，还有 2 例 47,X, inv (Y)(p11q11) ,inv (Y)(p11q11)胎儿，均为无创DNA 异常。

2.2.5 Y 染色体结构异常胎儿 12 例 inv(Y)(p11q11) 胎儿中，2 例为孕妇高龄，1 例为唐筛高危，4 例为超声异常，包括NT 增厚3 例、脐膨出1例，2 例为无创异常， 包括21 三体高风险 1 例，3例为不良孕产史。 46,X,Yqh-胎儿4 例，46,X,Yqh+胎儿 1 例，46,X,Yqs 胎儿 1 例。 46,X,psu idic(Y)(p11.3)胎儿1 例，其父亲染色体为47,XYY。

2.2.6 X 染色体片段缺失胎儿 46,X,del (X)(p22.3)胎儿1 例， 超声提示右锁骨下动脉迷走，CMA：Xp22.33p22.31×1。 46,X,del(X)(p11.2p21.1)胎儿 1例，其母亲染色体核型为46,X,del(X)(p22.1)。 46,X,del (X)(q22q26) 胎儿 1 例， 为无创 DNA 异常。Xp22.31 微缺失 2 例，均为唐筛高危。 Xp26.2 微缺失胎儿1 例，夫妇为地贫携带者。

2.2.7 X 染色体片段重复胎儿 Xp22.31 微重复胎儿 13 例，5 例为唐筛高危，7 例为超声异常,分别有NT 增厚、鼻骨未显示、马蹄内翻足、室缺、室缺合并永存左上腔、单脐动脉合并左心室强光点、唇裂合并脉络膜囊肿，1 例为父亲染色体平衡易位。 46,X,add(X)(p22.1) 1 例,为无创 DNA 异常。 Xq28 微重复1 例，为无创 DNA 异常。 Xq12 微重复 1 例，为唐筛高危。

3 讨论

性染色体异常包括性染色体数目异常和结构异常。性染色体非整倍体(sex chromosome aneuploidies, SCAs)为性染色体数目异常的主要类型,胎儿发生率约1/435[8],出生后发生率接近1/400[9]。 临床最常见的 SCAs 分别为 45,X、47,XXY、47,XXX 及47,XYY[10]。本组3591 名产前筛查高危孕妇中,共检出137 胎性染色体异常胎儿,总阳性率3.81%,其中SCAs 95 例，阳性率 2.64%，与 Allanah 等[11]报道的2.93%相似， 阳性率由高到低依次为47,XXY 、47,XYY、45,X 和 47,XXX 等。

表2 137例性染色体异常胎儿分类情况

近年无创DNA 筛查技术的普及是性染色体异常检出率升高的主要原因之一,该技术对21-三体、18-三体、13-三体具有较高的敏感度和特异性，其准确性随着技术的发展不断提升[12]。 但用于SCAs 时准确性差别较大， 阳性预测值在48.4%-54.5%之间[13-15]。 对 45,X、47,XXX、47,XXY、47,XYY的阳性预测值分别为 29%-38%、83%-100%、77%-83%和 83%-100%[14,16]。 本研究中无创 DNA 性染色体异常总体阳性预测值为51.85%(84/162)，与文献报道的范围相符，提示其有效性。 在检测性染色体时，错误的结果可能既有生物学上的原因，也有技术上的原因。 除了常见的限制胎盘嵌合(CPM)、母体染色体嵌合、母体拷贝数变异、母体肿瘤、双胎之一消失外[17]。 X 和Y 染色体存在较多同源基因， 以及测序长度较短时容易引起定位错误从而导致假阳性率过高[18,19]。 此外，X 染色体中的 GC 含量偏移，需在实践中纠正GC 偏倚或从染色体内部有效控制Z 值[20,21]。 对SCAs 的检出率可能随孕妇年龄增加而提高[22]。

在 12 例45,X 胎儿中，8 例为早期超声发现NT 增厚、颈部水囊瘤和全身水肿。病理上均考虑与颈淋巴回流障碍有关， 提示X 单体潜在的致病机制。 多项研究发现Turner 综合征与相关胎儿颈部水囊瘤,可应用早孕期超声检查提高检出率[23-25]。而16 例 45,X 嵌合体胎儿中，仅 1 例为 NT 增厚，核型为 45,X[43]/47,XXX[7]，CNV-seq 提示 X 单体嵌合约66%，在本组中嵌合比例较高，提示嵌合体的表型与异常细胞系比例存在相关性， 比例越高的临床表现越明显，超声的阳性率越高。

染色体嵌合在产前诊断中普遍存在， 可分为真性嵌合和假性嵌合。 真性嵌合一般指整个胎儿含有两种或以上的细胞系， 形成机制为细胞分化发生之前的有丝分裂错误， 假性嵌合指细胞嵌合仅发生在机体某一个局限的区域，如脑、胎盘和生殖腺等。 由于孕中期羊水细胞来源多样化，可来源于胎儿、胎盘、羊膜、母体细胞等，假性嵌合可能性高，而孕中后期脐带血细胞来自于中胚层，在一定程度上更接近于真性嵌合。 本研究中，孕中期羊水细胞性染色体嵌合发生率为0.59%，孕中后期脐静脉穿刺检测的性染色体嵌合发生率为 0.17%，其差异可能与真假性嵌合有关。 本次研究中有19 例为性染色体异常嵌合体， 其中15 例为无创DNA 检出，提示无创DNA 筛查对性染色体嵌合体检出也有一定作用。 理论上嵌合体的表型与异常细胞系的比例有关， 但性染色体嵌合患者的临床表现变异较大，临床症状与异常核型比例不尽相同，如体细胞嵌合和X 染色体失活等[26]。因此通常需要应用多种检测技术如 FISH、CMA 等方法， 同时结合超声检查进行综合评估， 在遗传咨询中充分告知孕妇及家属各种检测技术的局限性和核型与表型的不一致性，以及胎儿性腺发育的特殊性。 性染色体异常胎儿的预后有时较难评估，需随访至青春期。

CNVs 是由染色体发生重排而导致的染色体亚显微水平的微缺失和微重复， 属于结构变异的一种。传统的核型分析已不能满足对CNVs 检测的需求， 本研究通过CMA/CNV-seq 技术在18 例核型分析正常的胎儿中检出染色体微缺失/微重复，阳性率提高0.5%。其中7 例为超声异常，提示对胎儿超声异常的孕妇进行产前诊断时加做CNVs 检测的必要性。 同时对4 例核型结构异常的胎儿进行了更精确的定位和致病性判读， 进一步协助遗传咨询。 其中一例为无创DNA 提示性染色体增加，核型分析为 46,X,add(X)(p22.1)，FISH 检测发现Y 染色体信号，而CMA 结果显示X 染色体拷贝数为 2、Y 染色体拷贝数为 1， 考虑为特殊形式的Klinefelter 综合症。 本研究中无创异常组中CNVs的检出率较低，考虑与测序深度有关。 有关研究显示，NIPT 的检测能力主要由胎儿 DNA 浓度和CNV 大小决定，在不增加测序深度的前提下，胎儿CNVs > 5 Mb 时才具有较高的灵敏度[27]。

总之，无创DNA 检测以及产前超声筛查的应用对于胎儿性染色体异常的检出具有有重要价值， 把握适应症的同时充分运用多种遗传学检测技术可以有效提高产前诊断阳性率， 并对进一步的遗传咨询提供精确指导。