血管紧张素转换酶2对人胰腺癌细胞BxPC3体外增殖及成瘤性的效应研究

周 琳，彭孝倩，刘 源，史成章，张连峰

郑州大学第一附属医院消化科，河南 郑州 450052

胰腺癌是恶性程度很高的消化系统肿瘤，发病隐匿、缺乏理想的治疗手段，预后极差，5年生存率低于5%[1]。阐明胰腺癌的发病机制及改善预后依然是医学领域中的一道难题。血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是与血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)具有同源性的Ⅰ型跨膜金属羧肽酶，在肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)中发挥关键作用。最近，因其作为SARS及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的宿主细胞受体再次受到关注[2]。本课题组前期研究发现，与正常胰腺组织相比，ACE2在胰腺癌组织中表达明显降低[3]，提示ACE2表达及功能缺失可能在胰腺癌发病中起到促进作用。本研究通过建立稳定过表达ACE2的胰腺癌细胞株BxPC3，通过观察ACE2在体外对胰腺癌细胞增殖及成瘤性的影响，探讨相关机制，以期为胰腺癌的治疗和研究探索新途径。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂本研究选用的人胰腺导管癌细胞株BxPC3(ATCC：CRL-1687)购自美国模式生物中心(American Type Culture Collection，ATCC，USA)，由课题组培养传代；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。RNA抽提试剂盒和逆转录试剂盒分别购自美国Invitrogen和Promega公司。ACE2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，Caspase-3、β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司。Envision免疫组化试剂盒购自法国DAKO公司。

1.2 细胞培养及质粒转染将人胰腺癌细胞BxPC3培养于含质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度条件下传代培养，每天换液保证细胞浓度维持在2×105～4×105的最佳生长状态，台盼兰检测细胞活力>90%，选用对数生长期细胞进行实验。ACE2表达质粒(pReceiver-M02-ACE2)与空白对照质粒(pReceiver-M02-GFP)由本课题组前期构建。转染过程：将3×105细胞接种到6孔板中，培养24 h，转染时将ACE2质粒和对照质粒DNA各0.4 μg/孔和10 μl Polifect转染试剂(美国Qiagen公司)混合，加入500 μl/孔无血清培养液，共同孵育4 h后换为完全培养液，细胞在37 ℃、体积分数为5%的CO2的条件下培养。

1.3 建立稳定高表达ACE2的BxPC3细胞株于转染24 h后更换细胞培养液，48 h 后加入400 μg/ml G418；4周后，待稳定转染ACE2及GFP对照质粒的BxPC3细胞克隆形成后，挑取克隆(分别命名为BxPC3/ACE2和BxPC3/GFP)，培养在含200 μg/ml G418的培养液中维持生长和传代。

1.4 Western blotting检测细胞离心沉淀后加入裂解液，RC-DC法进行蛋白定量，取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维膜(Bio-Rad公司)。取30 μg蛋白加样于12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，待电泳结束，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，100 V电压下转膜80 min；将质量浓度为50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h后，先后与特异性抗ACE2多克隆抗体、Caspase-3多克隆抗体在4 ℃孵育过夜，用辣根过氧化物酶连接的二抗孵育，X光片曝光和洗片。

1.5 MTT法检测细胞增殖情况使用CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)，通过检测WST-8的剪切水平观察各处理细胞的增殖情况。具体方法如下：将BxPC3/ACE2(实验组)、BxPC3/GFP(阴性对照组)和BxPC3(空白对照组)三组样本，以每组5×103细胞接种于96孔板，分别培养24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续孵育4 h，酶标仪测定溶液在450 nm处的吸光度值(OD450)。

1.6 克隆形成实验配制终浓度约0.3%的琼脂，将细胞(2 000个细胞、体积为1 ml)在37 ℃、体积分数为5%的CO2及饱和温度湿度环境下培养2周；取出6孔板，每孔加入70%乙醇3 ml固定60 min；吸出乙醇，加入质量浓度为2 g/L的结晶紫染色30 min；70%乙醇脱色，倒置显微镜计数含50个细胞以上的克隆，并计算克隆形成率。

1.7 胰腺癌细胞的凋亡检测

1.7.1 流式细胞仪：收集实验组、空白对照组及阴性对照组细胞各1×106个。70%冰乙醇固定，100 μg碘化丙啶(PI，250 μg/ml，美国Sigma公司)染色，4 ℃避光30 min，流式细胞仪(EPICS XL，Coulter)检测24、48、72 h三个时间点的细胞周期。本实验重复3次。

1.7.2 Capase-3蛋白检测：详见1.4 Western blotting检测。

1.8 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多组间均值的两两比较采用SNK法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACE2在各组胰腺癌细胞中的表达Western blotting显示，实验组BxPC3/ACE2细胞中ACE2蛋白的表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组细胞，两对照组间的ACE2蛋白水平低且差异无统计学意义，说明稳定过表达ACE2的胰腺癌细胞株BxPC3/ACE2构建成功。

2.2 MTT法检测细胞增殖情况分别在细胞培养24、48、72 h后检测细胞增殖情况。结果提示：在48 h和72 h两个时间点，实验组的OD值与阴性对照组和空白对照组相比均有下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示ACE2基因过表达后，BxPC3细胞的增殖能力明显受到抑制(见表1)。

表1 不同处理组细胞的增殖能力

2.3 ACE2过表达对胰腺癌细胞体外成瘤性的影响

克隆形成实验结果显示，细胞培养于软琼脂16 d后，实验组、阴性对照组和空白对照组三组细胞的克隆形成率分别为(7.3±1.2)%、(17.2±3.5)%和(15.3±3.1)%，差异有统计学意义(P<0.05)。与两对照组相比，实验组不仅形成的克隆数目少，且克隆的体积也相对较小(见图1)。

图1 各组克隆形成情况

2.4 胰腺癌细胞凋亡检测

2.4.1 ACE2过表达对胰腺癌细胞周期的影响：为了分析ACE2在体外抑制胰腺癌细胞BxPC3增殖的原因，我们检测了24、48、72 h三个时间点不同处理组的细胞周期变化情况(见表2)。结果显示，与阴性对照组和空白对照组细胞相比，实验组细胞的周期分布发生明显改变：其处于G1调控点的细胞比例增加，而S期细胞比例减少，与两对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 培养72 h后不同处理组细胞的细胞周期分布

2.4.2 ACE2对血清撤除诱导的细胞凋亡的影响：本研究采用撤除血清作为诱导细胞凋亡的诱因。Caspase-3的免疫印迹显示，从血清撤除后24 h开始，实验组即出现典型的Caspase-3条带，提示 ACE2基因促进了胰腺癌细胞BxPC3细胞在血清撤除后的凋亡(见图2)。

图2 各组细胞在血清撤除24、48 h的Caspase-3检测

3 讨论

RAS系统是人体重要的激素系统之一，主要包括肾素、ACE、血管紧张素原和血管紧张素Ⅱ，用于协调血压及细胞外液量的平衡。除全身性RAS系统外，在心血管等器官组织中还存在相对独立的局部RAS系统，通过旁分泌和(或)自分泌方式参与机体的生理活动[4]。近年来研究[5]发现，人胰腺组织局部同样具备独立作用的RAS系统，其整体功能失调可能参与了部分胰腺疾病的发病过程。

ACE2作为RAS家族的新成员，是与ACE具有同源性的Ⅰ型跨膜金属羧肽酶，在RAS中发挥关键作用。最近，因ACE2作为SARS或SARS-CoV-2感染人体的关键分子，再次受到研究人员的关注[2]。ACE2在心脏、肺、肾脏和胃肠道都有表达，因此通过该靶点进行感染的病毒不仅会在呼吸道中引发病变，也会引起一系列消化道症状。近期初步研究也认为，SARS-CoV-2引起的重症患者多脏器功能衰竭与ACE2的病毒受体功能有密切关联。ACE2通过水解AngⅠ羧基端脯氨酸与苯丙氨酸之间的肽键，生成Ang-(1-7)，Ang-(1-7)通过其特异性Mas受体及与激肽系统的交互作用发挥其拮抗AngⅡ的作用。近年来研究发现，RAS系统中的不同成员在肿瘤发病中可能起到了不同生物学效应[6-9]。譬如，本课题组既往研究[3]发现，胰腺导管癌组织中ACE2蛋白表达与癌旁正常胰腺组织相比，明显下降，提示胰腺组织局部ACE2表达缺失可能在胰腺癌的发病过程中起了一定的促进作用。

本研究中，我们首先建立稳定高表达ACE2基因的BxPC3细胞，观察ACE2基因对BxPC3细胞在体外增殖及成瘤性的影响。结果显示，细胞培养48 h以后，稳定高表达ACE2的胰腺癌细胞株增殖速度明显减慢，与空白对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义。接下来，我们采用克隆形成实验观察各组细胞在体外的成瘤性。结果显示，与两对照组相比，BxPC3/ACE2组不仅形成的克隆数目少，而且克隆的体积也相对较小，进一步证实ACE2在体外具有抑制胰腺癌细胞BxPC3增殖及成瘤的能力。为了探讨相关机制，我们通过流式双染AnnexinⅤ/PI法和Caspase-3蛋白检测探讨各组细胞在血清撤除后的自然凋亡情况。细胞凋亡是细胞为维持内环境稳定，更好地适应生存环境而主动形成的一种自我死亡过程，它涉及一系列基因的激活、表达、调控等作用。流式细胞仪分析细胞周期显示，ACE2基因对胰腺癌细胞的有丝分裂起到抑制作用，当细胞换代培养至72 h，稳定高表达ACE2的胰腺癌细胞的凋亡率与空白及阴性对照组相比，差异均有统计学意义。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是位于哺乳动物细胞凋亡通路下游关键的死亡蛋白酶。胞质中的Caspase-3在正常情况下以无活性的酶原形存在，细胞凋亡信号出现后可导致Caspase-3裂解、活化，活化的Caspase-3进一步导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向死亡[10]。本研究中，我们采用了撤除血清诱导凋亡的方法，避免了相关药物诱导的细胞毒性作用。结果显示，与对照组相比，实验组自血清撤除的24 h开始，即显示出典型的Caspase-3剪切片段，提示ACE2基因促进了胰腺癌细胞在体外的凋亡过程。以上实验结果表明，ACE2在体外作用于BxPC3细胞，无论在抑制细胞的增殖方面，还是诱导凋亡方面，均有明显促进作用。

综上所述，本研究显示，ACE2蛋白可通过促进胰腺癌细胞BxPC3的凋亡过程，进而抑制胰腺癌细胞BxPC3在体外的增殖及成瘤能力。ACE2基因作为RAS系统新成员，在越来越多的疾病中受到人们关注，也有望成为胰腺癌治疗的新靶点。进一步深入探讨ACE2在胰腺癌发病学中的生物学功能是必要的。