苗药黑骨藤UPLC-MS∕MS 指纹图谱研究

刘 耀，胡 蝶，程 纯，刘 杰，徐 剑

（贵州中医药大学，贵阳 550025）

苗药黑骨藤为萝藦科（Asclepiadaceae）杠柳属（Periploca）植物黑龙骨（Periploca forrestiiSchltr.）的干燥根或全株〔1〕。全株入药，具有通络、活血、解毒、祛风的功效，是苗族用于治疗风湿痹痛的常用药物。近年来，对于黑骨藤化学成分及药理作用的研究较多。药理研究表明黑骨藤具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等作用〔2-6〕，可用于急性痛风性关节炎及类风湿性关节炎的治疗〔7-8〕，化学成分研究表明黑骨藤中富含黄酮、皂苷、挥发油等活性成分〔9-13〕。指纹图谱作为控制药物质量及评价的有效方法，正广泛地应用于中药研究，目前黑骨藤化学成分的测定及指纹图谱的建立主要以高效液相色谱法（HPLC）为主〔14-15〕，还未见采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS∕MS）的方法对黑骨藤指纹图谱进行研究。本文采用UPLC-MS∕MS技术对黑骨藤进行研究，建立了黑骨藤UPLC-MS∕MS指纹图谱，确定了19个共有峰，鉴别了2个共有峰分别为绿原酸及杠柳毒苷，并利用相似度软件及化学计量学分析方法挖掘了图谱中的有效信息，为黑骨藤药材更加全面的质量评价提供了科学依据。

1 实验材料

1.1仪器超高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC，美国Waters公司）；质谱检测器（Waters-Xevo TQ，美国Waters公司）；质谱工作站软件（MassLynx TM，美国Waters公司）；分析天平（Auw120D，日本岛津公司）；电热恒温水浴锅（DK-98-II，天津市泰斯特仪器有限公司）；超声波清洗器（SK8210HP，上海科导超声仪器有限公司）。

1.2试剂绿原酸对照品（批号：160321，中国食品药品检定研究院）；杠柳毒苷对照品（批号：160617，成都植标化纯生物技术有限公司）；甲醇（色谱级，批号：17080670，TEDIA公司）；乙腈（色谱级，批号：17080654，TEDIA公司）；无水乙醇（色谱级，批号：20180319，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸（色谱级，CNW公司）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；不同产地的黑骨藤药材见表1，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定。

表1 10批不同产地的黑骨藤

2 实验方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取黑骨藤药材粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置于50 mL的具塞锥形瓶中，加入80%乙醇10 mL，称重，采用80℃水浴回流提取1 h，放冷后，将外壁擦干，用溶剂补足重量，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，备用。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、杠柳毒苷对照品适量，用甲醇溶解，分别制成161.2 μg∕mL 的绿原酸对照品溶液及 150.4 μg∕mL的杠柳毒苷对照品溶液，置于4℃保存，备用。

2.2色谱∕质谱条件色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱（150 mm×3.0 mm，1.7 μm）；样品室温度10℃，柱温25℃，进样量2 μL；流动相：水（A，含0.2%甲酸）-乙腈（B），梯度洗脱，程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

质谱条件：ESI正离子扫描模式；毛细管电压：3.0 kV；锥孔电压：30 V；脱溶剂气流量：N2，800 L∕h；脱溶剂气温度：550 ℃；锥孔气流量：50 L∕h；离子源温度：150℃；碰撞气体为氩气；质谱扫描范围：质荷比（m∕z）100～900。

2.3方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密称取S1黑骨藤药材，按“2.1.1”项下方法制备成供试品溶液，按“2.2”项下方法连续进样6次，测得各共有峰相对保留时间的RSD值在0.04%～0.21%，各共有峰相对峰面积的RSD值在0.76%～3.02%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 精密称取S1黑骨藤药材6份，分别按“2.1.1”项下方法制备成供试品溶液，按“2.2”项下方法进行测定，测得各共有峰相对保留时间的RSD值在0.03%～0.11%，各共有峰相对峰面积的RSD值在0.25%～2.06%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 精密称取S1黑骨藤药材，按“2.1.1”项下方法制备成供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24 h依次进样，测得各共有峰相对保留时间的RSD值在0.00%～0.07%，各共有峰相对峰面积的RSD值在0.32%～1.35%，表明该方法制备的供试品溶液在24 h内稳定。

2.4指纹图谱的建立

2.4.1 10批黑骨藤药材指纹图谱 精密称取10批不同产地的黑骨藤药材，按“2.1.1”项下方法制成供试品溶液，按“2.2”项下方法进行测定，得到10批黑骨藤药材的UPLC-MS∕MS指纹图谱，见图1；根据色谱峰相对保留时间及m∕z，确定了19个共有峰作为特征指纹峰，建立了黑骨藤药材的指纹图谱。见图2。

2.4.2 共有峰的标定 对比色谱峰的相对保留时间、分离度、峰面积及峰高稳定性等因素，选择保留时间为17.50 min处的3号峰（绿原酸）作为参照峰，分析得到各标定指纹峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表3～4。

2.4.3 共有峰的指认 采用UPLC-MS∕MS，选择电喷雾离子化（ESI）的方式，获得了黑骨藤样品的裂解信息，见表5，通过与对照品的比较分析，鉴定3号峰为绿原酸，7号峰为杠柳毒苷。

图1 10批黑骨藤药材的指纹图谱

2.4.4 相似度评价 采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”对10批黑骨藤药材图谱进行分析处理，得出10批黑骨藤药材的相似度，见表6。根据其结果可知，10批不同产地药材相似度均达到0.900以上，表明黔产黑骨藤质量相对稳定，差异较小。

2.5聚类分析设不同产地黑骨藤药材指纹图谱相对峰面积为变量，运用SPSS 22.0软件，采用组间连接法，对10批黑骨藤药材进行聚类分析，见图3。当欧氏距离为10时，10批黑骨藤药材可以分为4类，即S7为一类，S4为一类，S10为一类，余下的其他批次的药材为一类。由聚类结果可知，不同产地黑骨藤药材之间在具有相似性的同时也存在着一定的差异性，其原因可能与不同地区的土壤条件及气候环境差异有关系。

表4 黑骨藤药材UPLC-MS∕MS共有峰相对峰面积

表5 黑骨藤药材主要化学成分的鉴定信息

表6 10批黑骨藤药材相似度

3 讨论

研究表明，黑骨藤治疗类风湿关节炎的有效部位多采用80%的乙醇作为提取溶剂，故本实验选择80%乙醇进行回流提取，以提取时间、料液比、提取次数为变量，进行正交试验，最终确定供试品溶液的制备方法为80%乙醇作为提取溶剂，80℃回流提取1 h；在建立指纹图谱的过程中，为了解决峰型等问题，实验中先后考察了水-乙腈、水-甲醇、0.05%甲酸水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈等流动相系统进行梯度洗脱，结果表明以0.2%甲酸水-乙腈系统得到的图谱质量较好，获得的色谱峰峰型对称、分离效果好、基线平稳。

由于中药材受产地、采收季节、生长年限，环境等因素的影响，其化学成分种类及含量存在着差异，因此科学合理的质量评价方法是中药质量控制的关键，也是保证中药发挥临床疗效的前提。中药指纹图谱能够全面地反映中药中所包含的化学信息，避免了单一组分的局限性，体现了中医药整体的思想〔16〕。本试验采用 UPLC-MS∕MS 技术建立了苗药黑骨藤药材的指纹图谱，较HPLC而言，该方法能够更加快速、准确、灵敏地反映出不同产地黑骨藤化学成分的变化情况，并可以借助质谱定性的优势，更加全面地反映出苗药黑骨藤中化学成分的信息，可为苗药黑骨藤质量标准的提升提供参考，也可为其化学成分的深入研究提供科学依据。