Phaeosphaeriasp.HD-06菌株对马唐的致病性分析及初步鉴定

邹德勇　杨智越　杜春梅

摘要 为了得到能够有效抑制马唐Digitaria sanguinalis生长的生防微生物，在农田采集马唐种子，进行萌发试验，观察种子的萌发状况，从发病的种子和马唐幼苗基部分离致病菌，通过形态学观察以及ITS 序列分析对致病菌进行鉴定。结果从罹病的马唐幼苗基部分离得到一株致病菌HD-06，该菌株的发酵液用水稀释至60%浓度时，对马唐种子的萌发抑制率和幼苗发病率均达到100%，这说明菌株HD-06对马唐有较好的生物防治作用。根据其形态学特点及ITS 序列分析结果，鉴定菌株HD-06为暗球腔菌属Phaeosphaeria的真菌。这些结果为深入研究其对马唐的防治作用奠定了基础。

关键词 马唐; 生防菌; 致病性; 鉴定

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019166

Pathogenicity of Phaeosphaeria sp. HD-06 against Digitaria sanguinalis and the preliminary identification of the strain

ZOU Deyong1，2， YANG Zhiyue3， DU Chunmei1，2*

（1. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Heilongjiang University，

Harbin 150500， China; 2. Key Laboratory of Microbiology， College of Heilongjiang Province， School of Life Sciences，

Heilongjiang University， Harbin 150080， China; 3. Harbin Xingpu Feed Company， Harbin 150010， China）

Abstract

In order to obtain the effective biocontrol microorganism for inhibiting the growth of Digitaria sanguinalis， the seeds of crabgrass were collected in the farmland， and seed germination test was carried out. The germinating situation was tracked over time; meanwhile， the pathogens were isolated from the diseased seeds and the seedling base， and morphological observation and ITS sequence analysis were conducted to identify the pathogenic fungi. The results showed that a disease-causing strain named HD-06 was successfully isolated from diseased crabgrass seedling base. When the fermentation broth of strain HD-06 was diluted by 60% with water， the germination inhibition rate and seedling disease incidence rate of crabgrass reached 100% after treatment. It indicated that strain HD-06 had a good biological control effect on crabgrass. According to the morphological characteristics and ITS sequence analysis results， strain HD-06 was identified as a fungus of the genus Phaeosphaeria. These results laid a foundation for further research on its control effect on crabgrass.

Key words

Digitaria sanguinalis; biocontrol bacteria; pathogenicity; identification

马唐Digitaria sanguinalis是禾本科单子叶植物，是一种秋熟作物农田中的杂草，在热带和温带地区的36个国家均有分布，对30多种农作物的生产有严重危害[1]。由于马唐具有极强的抗逆能力和营养竞争力，能够在水、旱等多种类型的连作农田中快速蔓延，极难防除，被列为18种恶性杂草之一[2]。化学农药的长期施用导致马唐已经对草甘膦[3-4]、氟磺草胺、噁唑酰草胺、精噁唑禾草灵、烟嘧磺隆[5-6]等多种除草剂产生了抗药性。而一些化学除草剂具有的潜在致癌致畸毒性也导致人们对其应用产生了一定的抵触心理。而生物除草剂具有无毒、无害、无污染、生物安全性高，且不易产生抗药性等优点，成为化学农药的良好替代品，引起人们的广泛关注。

目前国内外可用于防除杂草的真菌主要有10属8种[7]，其中柄锈菌属Puccinia sp.、镰刀菌属Fusarium sp.、尾孢属Cercospora sp.、链格孢属Alternaria sp.等的种类较多，目前在生产中应用的真菌除草剂主要有Collegeo（主要成分为盘长孢状刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides）、Devine（主要成分为棕榈疫霉Phytophthora palmivora的厚垣孢子懸液）、鲁保一号（主要成分为胶孢炭疽菌菟丝子专化型Colletotrichum gloeosporioides（Penz.） Sacc. f.sp. cuscutae）和Biochon（主要成分为银叶菌Chondrostereum purpureum）以及敌散克（主要成分为画眉草弯孢霉菌Curvularia eragrostidis QZ-2000），其中敌散克是主要针对马唐研制的真菌除草剂[8]。另外，许多细菌及其代谢物也具有防除马唐的作用，如日本研发的细菌除草剂Camperico（主要成分为甘蓝黑腐病黄单胞菌Xanthomonas campestris pv. campestris JT4P82）已经商品化，链霉菌Streptomyces sp.638产生的茴香霉素能防除马唐和稗草[9]，假单胞菌、欧文氏菌、细菌S4[10]对马唐也具有良好的防效。尽管已报道的对马唐有致病性的菌株有很多，但是真正商品化的防除马唐的微生物制剂种类相对较少，且由于各种生防菌株的寄主范围不同，其应用往往受到一定的限制，不能完全满足生产的需要。因此，继续分离、筛选和鉴定马唐生防菌株能够为研发新型、高效的生物除草剂提供微生物品种资源，具有重要的科学意义和广泛的应用前景。

已报道的马唐致病菌多是从罹病的叶片分离得到的，极少有从种子和罹病幼苗上分离得到[11]。黑龙江大学微生物学重点实验室从罹病马唐幼苗的基部分离到一株能够有效抑制马唐种子萌发和幼苗生长的生防菌株，对其进行了形态学观察和ITS序列分析，为后续进一步研究其防除马唐的机理，开发新型除草剂奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马唐种子：鉴于秋季采集的马唐种子萌发率较低，而越冬的种子萌发率较高，本试验采用的种子为3月末从黑龙江省齐齐哈尔市梅里斯区雅尔塞镇农田采集的自然条件下越冬的种子。

培养基：以马铃薯葡萄糖培养基（PDA）为固体培养基，在PDA的基础上，不添加瓊脂为液体培养基，121℃灭菌20 min。

试剂：葡萄糖、琼脂、次氯酸钠、CTAB、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、溴化乙锭、琼脂糖、dNTPs（2.5 mmol/L）、10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶和DNA Marker DL2000，均购于宝泰克有限公司。

仪器：DYY-12电泳仪，北京六一仪器厂;Omega 10 UVP凝胶成像系统，德国UVP公司;TC-512 Thermal CylerPCR仪，英国Techne公司;CX31体视显微镜，奥林巴斯有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 马唐病原真菌的分离

挑选外观成熟饱满的马唐种子，用2%次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗3遍，用灭菌滤纸吸干种子表面残留的水分后，置于铺有灭菌的湿润滤纸的培养皿中，每皿加10 mL无菌水， 25℃恒温保湿培养7 d，观察萌发情况，分别挑取发病种子和发病幼苗上的菌丝体接种于PDA培养基上，待菌落形成后，挑取菌落边缘的菌丝体，纯化培养，备用。

1.2.2 马唐生防菌株的筛选

用无菌水冲洗各分离株培养物表面，制成1×106个/mL的孢子悬浮液，对马唐种子浸种处理6 h，以无菌水为对照。然后置于铺有灭菌滤纸的无菌PDA培养皿中，每皿50粒，每处理3次重复，25℃光照培养箱中保湿培养，记录种子萌发率，计算萌发抑制率。

1.2.3 菌株HD-06的发酵液对马唐的致病性

皿栽试验：将菌株HD-06在PDA培养基上培养5 d，挑取菌丝体，接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中（每瓶装液量为50 mL/250 mL）中，28℃，180 r/min发酵培养4 d。发酵液用无菌水稀释至终浓度分别为60%、40%和20%，对马唐种子进行浸种处理，以无菌培养基作为对照，然后置于铺有灭菌保湿滤纸的无菌培养皿中进行萌发试验，每处理3次重复，调查种子的萌发率和萌发6 d后幼苗的发病率。

盆栽试验：为模拟大田土壤生态环境，采用未灭菌的花坛土壤进行盆栽试验。将花坛土与蛭石按照1∶1的比例混合。选取直径15 cm，高度14 cm的花盆，盆内装2/3的土。 每盆播撒100粒成熟饱满的马唐种子，对照组喷施20 mL无菌发酵培养液，处理组喷施20 mL发酵培养4 d的HD-06含菌发酵液，然后覆土1 cm，表层土压实平整后，室内自然温度条件下培养。每处理3盆。定期观察记录各处理马唐生长情况，在接种37 d后进行调查并记录数据。

1.2.4 生防菌株的鉴定

1.2.4.1 形态观察

将菌株HD-06接种于PDA平板上，28℃连续培养25 d，定期对菌株形态进行观察，测量和拍照。

1.2.4.2 分子生物学鉴定

采用CTAB法提取真菌DNA，采用上海生工生物公司合成的引物 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）对菌株的ITS序列进行PCR扩增[12]。50 μL PCR反应体系：10 μmol/L的上游引物和下游引物各2 μL、DNA模板2 μL、10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 1 μL、5 U/μL TaqDNA聚合酶1 μL，补充ddH2O至50 μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min;95℃变性1 min，54℃退火40 s，72℃延伸40 s，循环34次，产物送博仕生物公司进行测序。在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，并应用MEGA 5.1软件构建系统发育树，初步确定其系统发育地位。

根据生防真菌的形态学特征及ITS序列分析，查阅植物病原真菌鉴定手册和相关文献，明确其分类地位[13]。

1.3 计算和统计方法

萌发抑制率=（未萌发种子数/种子总数）×100%，利用SPSS软件Duncan氏多重比较进行差异显著性分析。种子萌发率=（已萌发种子数/种子总数）×100%，致病率=（发病株数/萌发总株数）×100%，用EXCEL软件t测验法分析检验处理间的效应，用SPSS软件LSD法检验平均值之间的差异。

2 结果与分析

2.1 马唐生防菌株的分离和筛选

从马唐种子和罹病幼苗基部共分离得到6株真菌。它们对马唐种子的萌发均表现出一定的抑制作用（表1），其中菌株HD-06处理对马唐种子的萌发抑制率最高，为43.0%，方差分析结果表明，各菌株间的萌发抑制率差异达到显著水平（F=38.95，P<0.05）。

2.2 菌株HD-06发酵液对马唐的致病性

皿栽试验结果表明（表2，图1），当对照组马唐种子的萌发率达到90%时，菌株HD-06的20%、40%和60%浓度发酵液处理的种子萌发率仅为30%、10%和0（F=1 733.33，P<0.01），差异达到极显著水平，说明HD-06的发酵液对马唐种子的萌发具有较好的抑制作用。各处理植株情况见图1，对照（图1a）幼苗叶片鲜绿，芽长和根长显著高于各发酵液处理（芽长F=13.1，P<0.05;根长F=510.75，P<0.01）（图1b、c），而发酵液处理的种子已多数霉烂发病，看不出种子原来的形状，只能看到致病菌的霉层和菌丝体;少数萌发并长成幼苗的种子，其长势、芽长、根长均显著低于对照（图1d）。虽然已萌发种子的霉烂程度要轻于未萌发的种子，仍能清晰地看出种子的形状，但其茎部和根部呈现明显的水渍状，且叶片明显变黄（图1e）。

盆栽试验结果（表3）表明，对照组与处理组间的发芽率、致病率、株高以及单株地上部干重都存在显著差异（发芽率F=45.0，P<0.01;致病率F=74.33，P<0.01;株高F=13.77，P<0.05;单株结籽数F=1.94，P>0.05;单株地上部干重F=64.66，P<0.01）。说明施用菌株HD-06可以起到抑制马唐种子萌发和幼苗生长的作用，具有较好的除草潜力。当然，可能由于土壤中的状况比较复杂，有较多的物理化学和生物方面的因素影响马唐的萌发和生长，导致盆栽防治效果不如皿栽防治效果好。这也说明，要想让生防菌株在田间表现更好的除草效果，除了需要高效菌株外，还需要合理的制剂方案，使用合理的助剂和施用方法，才能进一步提高微生物除草剂的应用效果。

2.3 菌株HD-06的鉴定

2.3.1 形态观察

对菌株HD-06的形态观察结果表明，在PDA培养基上，菌落正面蓝灰色，菌丝向上生长，毛绒状;菌落背面黑褐色，能观察到小黑点状的子囊壳，针刺时有坚硬感。培养15～20 d时，挑取小黑点部位压碎制片，在显微镜下观察，能看到大量的子囊簇生在垫状结构上（图2a）。子囊顶端圆，壁薄，圆柱状，大小为（52～103）μm×（7.7～11.6）μm，内含有8个子囊孢子，具有胶质鞘（图2b）;子囊孢子单列至3列，多为纺锤形，直或稍弯曲，大小（20.6～36）μm×（3.9～5.2）μm，L/W约为5.2，被5个隔膜分成6个细胞，中间细胞膨大，一端细胞略尖，另一端有一个尖细的柄细胞（图2c， d， e），中间的2～3个细胞均分布有较多的滴状油球。子囊孢子为黄绿色，中间两个细胞颜色较深（图2c， e）。孢子萌发时，颜色变深，呈褐色，细胞整体明显膨大，尤其是顶部细胞膨大成钝圆状，孢子一端萌發出丝状体（图2e）。

2.3.2 菌株HD-06的ITS序列分析

菌株HD-06的ITS序列长度为613 bp，将ITS序列提交到NCBI数据库中，应用BLAST软件从数据库中搜索出相关菌株的ITS序列，与已知菌的ITS序列进行同源性比较，分析其系统发育关系。GenBank数据库比对结果表明，菌株HD-06的ITS序列（MK110375）与座囊菌纲格孢腔菌目的暗球腔菌属真菌Phaeosphaeria sp. CBS123.76（KF251194.1）和小球腔菌属Leptosphaeria sp. VegaE4-83（EF694661.1）相似度均为99%，集合在同一大分支（图3），且暗球腔菌属真菌和小球腔菌属真菌的ITS序列在系统发育上极为相近，即菌株HD-06可能是格孢腔菌目真菌中的暗球腔菌属或小球腔菌属真菌。

2.3.3 鉴定结论

菌株HD-06的形态学特征符合子囊菌亚门座囊菌纲格孢菌目的形态学特征[14]。暗球腔菌属Phaeosphaeria 和小球腔菌属 Leptosphaeria 都是格孢腔菌目中的大属，而且亲缘关系较为相近，它们的ITS序列在系统发育上界限并不清晰，建属初期关于它们的分类学地位一直存在争议[15]。Holm在格孢菌科的研究中，将Phaeosphaeria界定为一个独立的属，理由是这类菌的子囊座具有拟侧丝，将P.oryzae I. Miyake定为模式种，并将原来属于Leptosphaeria Ces. & De Not. 的17个具有由拟

薄壁组织构成的小子囊座和具单子叶植物寄主的种移入Phaeosphaeria中[16]。李文英等利用18S和28S

序列对座囊菌目及相关类群属间关系的系统学进行了初探，发现格孢腔菌目参试的 7 个属形成一个单系群，但属间的支持率非常低[17]。分子系统学研究表明子囊及子囊孢子的形态及寄主范围（侵染单子叶植物的通常为Phaeosphaeria，侵染双子叶植物的通常为Leptosphaeria）对界定这两个属菌株的分类地位非常重要[18]。菌株 HD-06所侵染的马唐为单子叶植物，因此，根据其寄主，我们将菌株HD-06初步鉴定为暗球腔菌属Phaeosphaeria真菌。

3 讨论

马唐是世界性恶性杂草，现有的微生物源除草剂还不能满足农业的需求。因此，广泛筛选对马唐具有防除作用的生防微生物，具有较重要的科学意义。我们分离到的生防真菌HD-06的发酵液能够抑制马唐种子的萌发，对马唐幼苗有强致病性，具有开发为生物除草剂的潜力，经形态学、分子生物学特性及其侵染单子叶植物的综合特征，鉴定该菌株为暗球腔菌属真菌。目前相关文献已经报道了10个属的真菌对马唐具有良好的防除效果，包括刺盘孢属Colletotrichum、疫霉属Phytophthora、镰刀菌属Fusarium、交链孢属Alternaria、柄锈菌属Puccinia、尾孢属Cercospora、叶黑粉菌属Entyloma、壳单孢菌属Ascochyta、核盘菌属Sclerotinia、弯孢属Curvularia[19]，而上述10个属的真菌多数是从马唐叶片分离得到的，至今未见有关在马唐的种子上分离到暗球腔菌属真菌的报道。菌株HD-06的分离与鉴定，扩大了马唐生防菌的资源库。

到目前为止，暗球腔菌属Phaeosphaeria已有114个种[20]，中国对该属研究报道较少，乔倩等曾报道了中国黄海黄岛海域潮间带木上的2个中国新记录种新海暗球腔菌P.neomaritima 和高山暗球腔菌P.subalpina[21];于辉霞等报道了来自福建武夷山、安徽黄山和山东昆嵛山的3个中国新记录种，肩状暗球腔菌P.humerata、马西山暗球腔菌P.marciensis和香蒲暗球腔菌P.typharum[20]。但是在马唐上未见分离到该属致病真菌的报道。

4 结论

HD-06为暗球腔菌属Phaeosphaeria真菌，该菌株60%浓度的发酵液对马唐种子的萌发抑制率为100%，处理后马唐幼苗发病率达到100%;在盆栽试验中发现经其发酵液处理后的马唐种子的萌发抑制率和幼苗发病率均远远高于空白对照组，且对马唐植株的株高、结籽数以及干重都有显著影响，显示出对马唐的萌发和生长都有很好的抑制效果。今后我们将对菌株HD-06的寄主范围和安全性进行评估，对其侵染和发病过程进行观察，分析其致病机理，并在此基础上对其发酵条件进行优化，对发酵液中能够防除马唐的有效物质进行分离纯化，为开发新型马唐生物除草剂奠定基础。

参考文献

[1] 李健， 李岩， 高兴祥， 等. 马唐生防菌厚垣孢镰刀菌ZC201301的生物学特性研究[J]. 草业学报， 2016， 25（3）：234-239.

[2] 陈世国， 强胜， 毛婵娟. 草甘膦作用机制和抗性研究进展[J]. 植物保护， 2017，43（2）：17-24.

[3] GREEN J M. Current state of herbicides in herbicide-resistant crops [J]. Pest Management Science， 2014，70（9）：1351-1357.

[4] 李玉， 宗涛， 杨浩娜， 等. 长江中下游棉田马唐（Digitaria sanguinalis）对草甘膦的抗药性初步研究[J]. 棉花学报， 2016，28（3）： 300-306.

[5] LI Jiao， LI Mei， GAO Xingxiang， et al. A novel amino acid substitution Trp574Arg in acetolactate synthase （ALS）confers broad resistance to ALS-inhibiting herbicides in crabgrass （Digitaria sanguinalis） [J]. Pest Management Science， 2017， 73（1）：2538-2543.

[6] MEI Yu， SI Chong， LIU Mingjie， et al. Investigation of resistance levels and mechanisms to nicosulfuron conferred by non-target-site mechanisms in large crabgrass （Digitaria sanguinalis L.） from China [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2017， 141：84-89.

[7] 屈洋， 馮佰利. 杂草生物控制技术研究进展[J]. 中国农学通报， 2019， 35（4）：114-121.

[8] 王建书， 朱云枝， 赵敏， 等. 画眉草弯孢霉菌株QZ-2000与低剂量化学除草剂复配增效机制研究[J]. 河南农业科学， 2010， 39（10）：65-67.

[9] 冀营光， 黄亚丽， 史延茂， 等. 细菌除草剂马唐致病菌的筛选[J]. 生物技术，2006，16（3）：71-74.

[10]杨叶， 胡美姣， 王兰英. 马唐草新月弯孢霉生物学特性及其代谢产物活性测定[J]. 中国生物防治， 2009，25（2）：154-159.

[11]IKLEY J T， WISE K A， JOHNSON W G. Annual ryegrass （Lolium multiflorum）， johnsongrass （Sorghum halepense）， and large crabgrass （Digitaria sanguinalis）are alternative hosts for Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis， causal agent of gosss wilt of corn [J]. Weed Science， 2017， 63（4）：901-909.

[12]KHAN A M， BHADAURIA S. Molecular characterization of keratin degrading fungi isolated from semi-arid soil by PCR using ITS4 and ITS5 primers [J/OL]. Journal of King Saud University-Science， 2018. DOI： 10.1016/j.jksus.2018.04.014.

[13]SOUZA A R C D， BALDONI D B， LIMA J， et al. Selection， isolation， and identification of fungi for bioherbicide production [J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2016， 48（1）：101-108.

[14]SENANAYAKE I C， JEEWON R， CAMPORESI E， et al. Sulcispora supratumida sp. nov. （Phaeosphaeriaceae， Pleosporales） on Anthoxanthum odoratum from Italy [J]. Journal Citation Reports， 2018， 38： 35-46.

[15]HYDE K D， JONES E B G， LIU Jiankui， et al. Families of Dothideomycetes： In loving memory of Majorie Phyllis Hyde （affectionately known as Mum or Marj）， 29 August 1921-18 January 2013—without mums determination， a character passed on to children， this treatise would never have been completed—K.D. Hyde [J]. Fungal Diversity， 2013，63（1）：1-313.

[16]HOLM L. Etudes taxonomiques sur les pléosporacéess [J]. Symbolae Botanicae Upsalienses， 1957， 14（3）：1-188.

[17]李文英， 庄文颖. 座囊菌目及相关类群属间关系的系统学初探[J]. 菌物学报，2009， 28（2）： 161-170.

[18]SENANAYAKE I C， CROUS P W， GROENEWALD J Z， et al. Families of Diaporthales based on morphological and phylogenetic evidence [J]. Studies in Mycology， 2017， 86（C）：217-296.

[19]ZHANG Lihui， KANG Zhanhai， JIAO Xu， et al. Isolation and structural identification of herbicidal toxin fractions produced by Pythium aphanidermatum [J]. Journal of Integrative Agriculture， 2010， 9（7）：995-1000.

[20]于辉霞， 迟胜起， 李秀岚， 等. 暗球腔菌属三个中国新记录种[J]. 菌物学报， 2013， 32（1）：136-141.

[21]乔倩， 金静. 暗球腔菌属的2个中国新记录种[J]. 青岛农业大学学报（自然科学版）， 2011， 28（1）：44-46.

（责任编辑：田 喆）