不同磷源对酿酒酵母发酵代谢产物的影响

饶轶晟，胡国涛*，王凤霞，张 红，吴雪君，刘黔霞

（1.中低品位磷矿及其共伴生资源高效利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550016；2.瓮福 （集团）有限责任公司，贵州 贵阳 550000）

碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水分六大营养物质为微生物提供了生长繁殖和代谢的条件，并为合成产物提供相应的营养物质基础［1］。无机盐主要可为微生物提供除碳源、氮源以外的各种重要元素，在微生物发酵的作用是构成菌体细胞成份，作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂，调节培养基的渗透压、pH、氧化还原电位等，对发酵菌体的影响效果虽不及碳源和氮源，但适量的添加可促进菌体健康快速的生长繁殖提高其代谢产物量［2］。磷常以磷酸盐的形式加入到培养基中，据市场调研，在微生物发酵工业化生产过程中，考虑到用量大，混合难度等问题，大部分微生物发酵厂家多使用食品级磷酸代替磷酸盐。因此，磷酸对微生物生长及发酵具有重要作用。

磷酸是一种常见的无机酸，属于中强酸，可广泛应用于洗涤、食品、制药、颜料、电镀、防锈等行业。 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》［3］（GB2760-2014）中食品工业用加工助剂使用中明确规定，磷酸可作为食品工业用加工助剂（发酵用营养物质）在发酵工艺上使用，因此本文特将磷酸作为发酵营养物质磷源使用。为探究磷源对酿酒酵母发酵的影响，本试验选取了酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen）作为培养对象进行相关试验。

1 实验部分

1.1 原料及试剂

试验菌种：酿酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisi-ae Hansen）。

试剂：食品添加剂磷酸 （85%）、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、琼脂、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠、葡萄糖、氢氧化钾等，以上试剂均为分析纯。

培养基及试剂：培养基参照 《微生物学实验教程 （第四版）》［4］进行配制。YPD基础培养基、YPD磷酸盐培养基 （在基础培养基中添加磷酸二氢钾10 g）、YPD磷酸培养基 （在基础培养基中添加磷酸8.46 g，氢氧化钾4.2 g）。固体培养基配制：按照以上配方，每1000 mL培养基中加入20 g琼脂即可。1mg／mL葡萄糖标准液、DNS显色液参照文献［5］进行配制。

1.2 主要仪器和设备

BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅、DHP-9052B型恒温振荡培养箱、带紫外灯超净工作台、DB-XAB型石墨电加热板、PE Lambda722型紫外可见分光光度计等。

1.3 实验方法

1.3.1 酿酒酵母发酵

采用液体发酵进行试验。根据试验需要配置基础YPD、添加磷酸盐的YPD、添加食品添加剂磷酸的YPD培养基，并在该三种培养基接种同等菌含量的酵母菌，待发酵72h后判断三种培养基对酵母菌发酵的影响。详细试验过程参照文献［6-7］进行。

1.3.2 检测方法

1.3.2.1酵母菌发酵能力检测［8］

分别取各液体发酵培养基250.00 g于500 mL三角锥瓶中，灭菌后接种酵母种子液4%，精确称量总质量后于30℃振荡培养72 h后称量发酵液重量，每组培养基6个重复。因每瓶液体发酵培养质量及接种量相同，因此测单位时间内发酵液失重量为二氧化碳的产生量即可反应发酵能力。

1.3.2.2 发酵液残糖量测定［5］

将1.3.2.1培养72 h的发酵液于5000 r／min离心10 min，取上清进行残糖量检测。酒精度作为酿酒酵母发酵能力最重要的指标，与酵母糖转化利用率相对应，糖转化利用率高则相应酒精度高，反之糖转化利用率低则相应酒精度低［9］。

1.3.2.3 产酒精量测定［10］

取1.3.2.2 已离心的发酵液，过0.22μm无菌有机系滤膜。过滤完的液体即为待测样品。检测参照GB／T13662-2008，黄酒中酒精含量检测方法进行。

1.3.2.4 总酸、氨基酸态氮测定［10］

检测参照GB／T13662-2008检测方法进行。酒中的酸类物质作为主要的呈味成分，以总酸含量用来判定酵母产酸能力，具有一定依据。且酒含有的多种氨基酸，能被酵母进一步代谢生成重要风味物质高级醇［9］，因此也作为酵母发酵能力的一项重要指标。

1.3.4 数据处理方法

采用SPSS17.0软件进行数据分析，多重比较（LSD）确定组间差异，结果以 “均值±标准误”表示，EXCEL软件作表。

2 结果与分析

酿酒酵母发酵试验结果见表1。

表1 酿酒酵母发酵试验结果

由表1可知，1＃、2＃、3＃培养基中酿酒酵母发酵产生的二氧化碳含量分别为9.67、11.12、11.65 g／L，说明培养基中添加适量磷酸及磷酸盐与基础培养基相比能够产生更多的CO2，且磷酸盐与磷酸的CO2产生量略有差异但不显著，由此可知在培养基中添加适量的磷酸盐或磷酸均能够提高酵母菌的发酵能力。发酵液中残糖量可以反应酵母对糖的转化利用能力，试验初始培养基中含糖量相同，发酵结束后残糖量低，说明酵母对糖的转化利用率高，则说明发酵能力强。1＃、2＃和3＃培养基残糖量分别为18.08、10.16、8.627 g／L，说明2＃和3＃培养基中酵母对糖的转化利用率比1＃高；发酵液中酒精度 （体积分数）分别为3.75%、4.21%、4.47%，1＃相对2＃和3＃培养基酒精度较低；而2＃和3＃则没有显著性差异；总酸分别为：4.37、5.13、5.15 g／L；氨基酸态氮分别为0.72、0.83、0.85 g／L，1＃和2＃、3＃培养基之间存在显著性差异，2＃和3＃培养基之间无显著性差异。由此可说明培养基中添加磷酸盐和磷酸均能促进酵母菌发酵，且磷酸盐与磷酸的效果无显著性差异。

3 结语

通过在酿酒酵母发酵培养基中不添加磷源、以磷酸盐形式添加磷源、以磷酸形式添加磷源，发酵72 h后各培养基中二氧化碳产生量、残糖量、产酒精量、发酵液中总酸和氨基酸态氮生成量等指标的变化来判断磷源对酿酒酵母发酵的影响。由试验数据可知添加磷源，可提高酿酒酵母发酵能力；而以磷酸盐形式和以磷酸形式添加磷源，都能够为酿酒酵母发酵提供磷源，且促进发酵的效果一致。