不同剂量龙血生肌温敏凝胶对失神经支配创面促愈合的实验研究

董黎强，罗统富，金圣煊，魏 浩，刘启明，黄余亮，安忠诚

失神经支配创面一般指各种因素造成创面暂时性神经支配缺失而导致愈合困难，目前在临床上发病率呈上升趋势[1]。而对于失神经支配创面的治疗，近年来国内外涌现了诸多如负压封闭引流技术（VSD）、富血小板血浆(PRP)、皮肤祖源细胞、基因工程药物、中药、超声波、高压氧、电刺激等方法，相关研究结果均能收到一定效果，但疗效仍未尽如人意，有进行更深层次研究的必要。本课题组前期采用我院经验复方中药制剂龙血生肌膏治疗失神经支配创面，取得了较好的疗效，基础研究及临床病例观察均证实了龙血生肌膏对失神经创面有较显著的促愈合作用[2-4]，但由于药剂制备工艺、器械等条件限制，其药物的临床疗效仍未达到最佳状态，因此本研究将龙血生肌膏有效成分改制成温敏凝胶剂型，并将不同剂量的龙血生肌温敏凝胶应用于失神经支配动物创面进行实验，探索其最佳有效剂量，为下一步研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药物来源 SD大鼠由浙江中医药大学实验中心提供；龙血生肌温敏凝胶药物同龙血生肌膏，由浙江中医药大学附属第二医院中药房提供，再由杭州市创新中药标准化研究所有限公司制备温敏凝胶。药物制备是根据龙血生肌膏中每味中药的主要有效成分、临床用法等特点，分别采用乙醇提取、水提取以及粉碎制粉等工艺摄取出药物有效成分，再以水溶性高分子材料泊洛沙姆为载药基质，经过稳定性、重复性、专属性等试验，制备成高、中、低三种不同浓度的龙血生肌温敏凝胶。按生药量计算，三种剂量的温敏凝胶浓度分别为0.8、0.4、0.2 g/mL。凝胶触发温度为32～35℃，与人体正常体表温度接近。

1.2 动物分组及建立实验模型 将SD大鼠80只随机分成4组：高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组，各20只。大鼠于实验前2 d用脱毛膏行背部、腹部脱毛，以四肢为界线，方便后期的创面换药。将大鼠称重，以10%戊巴比妥钠（剂量25 mg/kg）进行腹腔麻醉，麻醉达成后，用直尺在T11与L2之间画一条平行脊柱水平线(大鼠背部肋脊角可作T13定位标志)，在T12、T13、L1间距离平行线右侧外1 cm处再画一直径为2 cm圆弧线（与中国人民银行2012年发行的5角硬币等大）；对术口进行常规的消毒铺巾，沿标记直线切开皮肤，剥离右侧的肌肉组织，松解斜方肌。先钝性分离T13神经根，向上在T11、T12肋下可发现T11和T12神经根并作钝性分离，同法分离出L1、L2神经根；从脊神经近端，用8-0线结扎切断T11～L2神经根0.5 cm，用5-0线逐层缝合斜方肌及皮下肌肉及皮肤，再对所画圆弧线作切除全层皮肤及肌膜下2 mm深肌肉的深创面模型，失神经支配创面模型的制备完毕，主要操作过程如图1。

图1 失神经支配创面动物造模的主要步骤

1.3 治疗方案 术后3 d按青霉素常规用量给大鼠肌注以预防手术切口感染。高、中、低剂量组分别用相对应剂量的龙血生肌温敏凝胶均匀涂抹创面后包扎；对照组使用凡士林纱布覆盖后包扎伤口；隔日换药一次。

1.4 观察指标及方法 （1）大体观察：建立动物模型后直至创面愈合，观察记录剩余大鼠创面的出血、红肿、肉芽生长、渗出物等情况。（2）创面愈合时间：计算并记录造模后各组大鼠创面愈合所需要的时间。（3）创面愈合率：在造模后的第4、7、11、14、21天共5个时点对创面进行等距离拍照，将图像扫入计算机，用Image Pro Plus软件计算创面愈合面积。计算创面愈合率=（原始面积－时间点面积）/原始面积。（4）于造模后第4、7、11、14、21天时，每组随机切取4只大鼠创缘皮肤和肉芽组织样本，经体积分数10%的甲醛固定48～72 h，酒精脱水，石蜡包埋切片，经HE染色后在200倍显微镜下随机选择10个视野，应用PAS病理图像分析系统对视野中成纤维细胞进行定量分析。

1.5 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察 四组实验动物创面均无明显发炎、皮肤坏死等情况。高剂量组及中剂量组肉芽生长情况相近，肉芽颗粒大，外观新鲜，色泽鲜红，轻触易出血，第7天开始明显向创面中央聚集且上皮化加速，第10天肉芽填满整个创面，第12天开始出现上皮化；而低剂量组较之稍差，对照组肉芽生长欠佳，肉芽颗粒较小，色泽苍白，创面收缩速度较前三组慢。高、中、低剂量组渗出量较多，均为浅棕黄色，渗液较稀，第9天开始逐渐减少，第11天仅有少量渗出；而对照组在整个实验过程中渗出量均少，创面较为干燥。

2.2 创面愈合时间比较 高剂量组及中剂量组愈合时间接近，均在第12天出现愈合的创面，到第14天两组创面均痊愈，两组数据差异无统计学意义。低剂量组第13天开始愈合，第15天痊愈，与高、中剂量组比较均有统计学意义。对照组创面愈合慢，直至第23才有愈合的创面，高、中、低剂量组与对照组均有极显著的统计学意义。统计数据见表1、图2。

表1 创面愈合时间比较

图2 四组创面愈合时间比较

2.3 创面愈合面积比较 在造模后的5五个实验时间点，高剂量组及中剂量组愈合速度差异无统计学意义，高、中、低剂量组比对照组愈合速度显著加快（P＜0.01）。高、中、低剂量组在第4天时创面愈合面积无明显差异（P＞0.05），在第7、11、14天时有显著差异（P＜0.05），而到第21天时，高、中、低剂量组创面均已全部愈合，数据差异无统计学意义。见表2、图3。

表2 创面愈合面积比较

图3 各组创面愈合面积百分比对比

2.4 创面成纤维细胞数量比较 高、中、低剂量组的创面成纤维细胞数量与对照组有显著差异（P＜0.01）。高、中、低剂量组均第11天达峰值，且高、中剂量组高于低剂量组及对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），其他时间点高、中、低剂量组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 创面成纤维细胞数量比较

3 讨 论

龙血生肌膏由古代敛疮名方“金枪铁扇散”加减化裁而来，由地龙、血竭、乳香、没药、黄柏、黄连、大黄、白芨、炉甘石等药物成方，方中取地龙通络、血竭化瘀止血及敛疮生肌之效同为君药，共奏活血生肌、通络止痛之功；乳香、没药活血止痛，消肿生肌，为痈疽疮疡之要药，二者为臣，可强君药之疗效，尽臣药之本分；佐以黄柏、黄连清热燥湿，解毒疗疮，大黄泄火解毒，破积行瘀，白芨收敛止血，消肿生肌，炉甘石敛疮等，全方尽显清热解毒、活血化瘀、祛腐生肌之功效。而现代的药理研究已证实地龙的提取液能促进巨噬细胞活化，大黄的大黄素有抑菌、抗炎、抑制血小板聚集、改善微循环作用，血竭的血竭素、乳香的挥发油、没药的树脂、血竭的血竭素、炉甘石的钙离子、白芨的黏液质等可加速炎性反应，促进创面愈合。研究发现，龙血生肌膏可调控神经因素对失神经支配创面有较明显的促愈合作用，但在使用过程中发现其存在某些不足，如有效成分颗粒粗大、使用时涂抹不匀、创面易有残留、药物起效不可控等。通过优化剂型改善上述不足或许能进一步提高龙血生肌膏的疗效。温敏凝胶目前在药剂领域是一大研究热点，其在使用之初是以液体形态存在的，通过人体体温触发其交联系统而由液态转变为半固体凝胶，在局部形成一层具有密闭性的薄膜。据报道，温敏凝胶剂型具有流动性突出、使用方法简便、药物局部停留时间长、药效发挥充分、缓释作用强等优点[5-6]。在本研究的预实验阶段，通过观察龙血生肌温敏凝胶在使用过程中的相关情况，发现其特性与既往报道相符。因此，温敏凝胶能满足龙血生肌膏剂型改进的要求，且其缓释作用又更利于药效发挥，同时温敏凝胶的缓释系统能降低药物副反应，使药物的安全性更好。因此，笔者设计了本实验，观察不同浓度药物对失神经支配创面愈合的影响是其中关注的焦点。

王清任曾言：“药味要紧，分量更要紧”，由此看出剂量是影响方药疗效的关键因素。又如吴鞠通所言：“治上焦如羽，非轻不举；治中焦如衡，非平不安；治下焦如权，非重不沉”，说明药物的不同功效也是由剂量的大小决定的。目前，有大量药剂学动物实验及临床观察研究均已证实药物的剂量与疗效有密切关联[7-9]。张卫红等[10]对中药量效关系的分析中提出：在药物质量保证、方药组成明确的前提下，药物的剂量对治疗效果起决定性作用。然而，中药复方的成分多、作用靶点广泛，疾病种类及个体差异等因素均对疗效造成影响，注定其量效关系的复杂性。即在临床研究中无法对复方中的每一个成分进行量化研究。为解决这个棘手的问题，有学者提出了“剂量阈”[11]研究方法，先计算出半饱和量（[D]0.5），再算最佳的剂量阈范围（[D]0.2～[D]0.8）而得到方药显效的剂量阈值（[D]0.2）。该方法仍处于探索阶段，目前未有明确结论，但有一定的实用价值。通过借鉴该计算方法，结合药物特性及临床需求本研究最后将龙血生肌温敏凝胶分别制备成高、中、低三种不同剂量进行动物研究。

方药量效关系的表现形式是多样化的，有量增效增者，有量增效减者，亦有表现量效多波折者[12]。理想药物剂量是指用最小的药量达到最佳的治疗效果。而盲目提高剂量可能无法增效，甚至起到量增效减的作用。传统医学是实践性很强的学科，以临证用药显效与否为评价标准。结合中药复方的复杂性，有学者提出“整体效”[13]的研究方法，即是否有效直接观察患者用药后的整体效果。在本研究中，以创面大体情况、愈合时间及愈合率作为观察“整体效”的指标，通过比较使用高、中、低三种不同剂量药物的“整体效”而得出哪一剂量药物疗效最佳的结论。这种研究方法符合中医传统的思维，也具备实验研究的科学性。

创面愈合需要大量肉芽组织增生才能完成，而失神经支配创面在愈合过程中表现出细胞增殖低下的病理改变，严重阻碍了愈合的速率。研究表明[14-15]，成纤维细胞大量增殖能加速创面基质沉淀及再上皮化速度，且细胞增殖标记抗体主要集中在上皮细胞及成纤维细胞中，故而肉芽基质在分子细胞学层面又以成纤维细胞为代表。本研究结果提示高、中、低剂量组均比对照组的成纤维细胞数量显著增多，说明龙血生肌温敏凝胶对失神经支配创面有明显的促愈合作用，而在增殖峰期，高、中剂量组比低剂量组的成纤维细胞显著增多，说明高、中剂量组的药物剂量更佳。

综上所述，本实验中分别用高、中、低三种剂量龙血生肌温敏凝胶治疗大鼠失神经支配创面，发现高、中剂量组的愈合时间及愈合率相近，均比低剂量组及对照组的更佳，且大体观察中也是中、高剂量组肉芽生长及渗出最佳，而组间无显著区别，从宏观层面证明药物的临床疗效。再通过观察成纤维细胞增殖数量变化，从微观层面说明药物的显效与促进细胞增殖有明显关联，最后通过比较这四组的整体效果，不难发现高、中剂量龙血生肌温敏凝胶组的疗效最佳，且最为接近理想药物剂量。值得期待的是，将来可应用中剂量龙血生肌温敏凝胶进行更深入的研究，为中药剂型改进提供思路和更多依据。