高效液相色谱法检测不同品种柑橘类果皮多甲氧基黄酮

刘洋，方迅，胡爽，凌敏，杨丽珠，徐兰英

（黄冈师范学院化学化工学院，催化材料制备及应用湖北省重点实验室，湖北黄冈438000）

柑橘果皮，为芸香科柑桔属植物橘（Citrus eticulata Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，可经过除去杂质、喷淋水、润透、切丝、干燥等一系列炮制过程得到传统中药陈皮，有理气调中，燥湿化痰的功效[1]。柑橘果皮中含有多种化学活性成分，包括黄酮类化合物（flavonoids）、生物碱类（alkaloids）、挥发油类（vplatile oil）、柠檬苦素类（limonoids）、多糖类及微量元素[2-3]。其中多甲氧基黄酮（polymethoxy flavonoids，PMFs）为柑橘特有的化合物，现代药理学研究表明其有广泛的生物活性[4-6]，其中甜橙黄酮能显著抑制癌细胞的增殖[7]。川陈皮素和陈皮素具有预防肥胖、辅助降血脂、抗炎的作用[8-12]。5-去甲基多甲氧基黄酮对人肺[13]、结肠[14-16]、乳腺[17]和白血病[18]癌细胞具有很强的抗增殖作用。5-去甲基川陈皮素和5-去甲基陈皮素是陈皮中最丰富的5-去甲基多甲氧基黄酮[19-21]。

随着陈皮研究的不断深入，研究者们发现，陈皮的药效及重要生物活性大多与陈皮多甲氧基黄酮相关。陈皮是由新鲜柑橘果皮制备而得，柑橘果皮中多甲氧基黄酮的种类和含量受到多种环境条件及不同基因型的影响[22]。柑橘果皮选材不同，所制得陈皮中药材中多甲氧基黄酮的种类和含量也会不同，进而影响到陈皮的药效。因此，分析不同品种、不同产地柑橘果皮中多甲氧基黄酮的含量，对于陈皮的选材及其质量控制具有重要意义。目前，已有以紫外分光光度法和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定不同川陈皮中橙皮苷、川陈皮素的含量[23]，也有研究者采用HPLC法测定不同陈皮药材中橙皮苷、川陈皮素和陈皮素等的含量[24]，以及用HPLC同时分析6种5-去甲基多甲氧基黄酮[25]。本文采用高效液相色谱法对6种主要多甲氧基黄酮（甜橙黄酮、川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮、陈皮素、5-去甲氧基川陈皮素、5-去甲基陈皮素）在9种不同品系、产地的柑橘中含量的差异进行了检测和分析，以期为陈皮的原材料选择、质量合理控制提供一定参考。6种PMFs的结构式见图1。

图1 6种PMFs的结构式Fig.1 Structures of six PMFs

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘新鲜果实：京东生鲜水果。

无水乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；多甲氧基黄酮（PMFs）、甜橙黄酮、川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮、陈皮素、5-去甲氧基川陈皮素、5-去甲基陈皮素标准品：催化材料制备及应用湖北省重点实验室自制，纯度均大于98%。

1.2 仪器与设备

GWX-9623MB型电热鼓风干燥箱、DZF-6020真空干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHZ-III循环水真空泵、RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；CCA-20型低温冷却水循环泵：巩义市予华仪器有限责任公司；BSA124S分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DS-5510DT型超声波清洗器：上海生析超声仪器有限公司；UPT-II-10T优普系列超纯水器：成都超纯科技有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本Shimudzu公司。

1.3 试验方法

1.3.1 HPLC条件

色谱柱：GL Sciences Intersil C18液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～55%乙腈；15 min～20 min，55%～70%乙腈；20 min～25 min，70%～80%乙腈；25 min～30 min，80%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；检测波长：326 nm；进样量：10 μL。

1.3.2 标准溶液的配制

分别精密称取甜橙黄酮、川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮、橘皮素、5-去甲基川陈皮素、5-去甲基橘皮素标准品各5.0 mg，用色谱甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，其质量浓度为0.5 mg/mL，将其作为标准储备液保存于4℃冰箱中，备用。采用逐步稀释法得到 0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL 一系列不同质量浓度的标准工作溶液，过0.22 μm滤膜后进样。

1.3.3 柑橘类果皮中多甲氧基黄酮的提取及检测

将市售重庆柑橘、安远脐橙、浦江美人桔、广东皇帝柑、广西沙糖桔、浦江丑橘、台州蜜桔、广西皇帝柑、赣南脐橙新鲜果实洗净烘干，收集果皮，将果皮洗净于70℃干燥，然后将其粉碎备用。称取干燥柑橘果皮粉末各1.0 g，用50 mL无水乙醇索氏提取至提取液无色，将提取液减压浓缩成稠膏状，称重。然后将所得稠膏用乙醇溶解，定容至100 mL得样品溶液，4℃保存备用。

将样品溶液取上层清液，过0.22 μm滤膜后直接注入进样瓶，按1.3.1色谱条件进行HPLC分析，检测柑橘果皮中多甲氧基黄酮包括甜橙黄酮、川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮、橘皮素、5-去甲基川陈皮素、5-去甲基橘皮素含量，计算含量时，每个样品平行测定3次取平均值。

1.4 数据处理

采用Excel 2010软件统计分析数据，计算标准偏差并绘制标准曲线。工作曲线绘制时所有试验数据均为重复3次的试验结果。

2 结果与分析

2.1 6种多甲氧基黄酮标准品的色谱分离

将6种多甲氧基黄酮标准品混合液，在1.3.1色谱条件下进行分离，结果如图2所示。

由图2可见，在给定的色谱条件下，6种主要多甲氧基黄酮均具有较好的峰形和分离度。

图2 多甲氧基黄酮高效液相色谱图Fig.2 Chromatograph of the six PMFs

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线的绘制

对不同质量浓度的多甲氧基黄酮标准溶液分别自动进样10 μL，按1.3.1色谱条件测定，记录峰面积。以各标准工作溶液浓度C（μg/mL）为横坐标，对应的峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，并进行回归计算得6种多甲氧基黄酮回归方程。将最小浓度的6种多甲氧基黄酮标准品溶液继续进行稀释，按照1.3.1的色谱条件进样测定，计算信噪比。每种黄酮在信噪比（S/N）为3和10处对应的多甲氧基黄酮标准品浓度作为检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ），结果如表1所示。

表1 方法学考察Table 1 Results of the method investigations

由表1可知，6种多甲氧基黄酮在2.5 μg/mL～500 μg/mL范围内线性关系良好，线性相关系数R2≥0.999 5。

2.2.2 日内和日间精密度

分别取质量浓度为0.05 μg/mL的6种多甲氧基黄酮标准溶液进行色谱分析，平行测定6次，记录6种多甲氧基黄酮的峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）得日内精密度；连续5 d对分别配制的6种多甲氧基黄酮标准溶液进行色谱分析，记录6种多甲氧基黄酮的峰面积，计算相对标准偏差得日间精密度，结果如表2所示。

由表2可知，6种多甲氧基黄酮标准品的日内日间精密度均小于2.8%，说明仪器精密度良好，可以满足试验要求。

表2 日内日间精密度、稳定性和重复性Table 2 Results precision，stability and repeatability test

2.2.3 稳定性考察

分别配制6种多甲氧基黄酮标准品溶液，配制完成后分别放置 0、2、4、8、12、24 h 后进行液相色谱分析，测定其峰面积，计算RSD值，考察方法的稳定性，结果见表2。试验表明，6种多甲氧基黄酮在24 h内稳定性良好，除3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮的 RSD 为 1.71%外，其它5种多甲氧基黄酮的RSD均小于0.7%。

2.2.4 重复性考察

按1.3.3方法平行制备6份样品溶液，在1.3.1色谱条件下，同时测定6种多甲氧基黄酮含量并计算RSD值，考察方法的稳定性，计算得RSD值均在2%以内，结果见表2，表明该方法的重复性良好。

2.2.5 回收率试验

分别称取0.50 mg 6种多甲氧基黄酮标准品溶液加入1.0 g干燥柑橘果皮粉末，按照1.3.3中的方法进行索氏提取、浓缩及溶液配制。将样品溶液取上层清液，过0.22 μm滤膜后直接注入进样瓶，按1.3.1色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积并按外标法计算样品加样回收率，将加样回收率测定过程重复5次并计算RSD，结果见表2。由表2可见，6种样品回收率都在97%至105%之间，回收率RSD值均在2.5%以内。

2.2.6 柑橘果皮中6种多甲氧基黄酮含量检测

采用建立的液相色谱法对10种不同品种柑橘果皮提取物中的6种多甲氧基黄酮进行了检测，采用保留时间和紫外光谱对照法对6种多甲氧基黄酮进行归属确证。相同色谱条件下，重庆柑橘果皮的液相色谱图见图3。

由图3可见，重庆柑橘果皮中川陈皮素和橘皮素含量均较高，但未检出5-去甲氧基橘皮素。

图3 重庆柑橘果皮提取物液相色谱图Fig.3 Chromatograph of the Chongqing citrus peel extracts

其它品种柑橘类果皮样品色谱图未一一在文中列出。根据液相色谱峰面积，将各多甲氧基黄酮峰面积代入表1回归方程，计算对不同品种中6种PMFs化合物的含量。结果如表3所示。

由表3可见，不同品种柑橘果皮中的多甲氧基黄酮含量有明显的差异，在这9种柑橘果皮样品中，重庆柑橘、浦江美人桔、广东皇帝柑、广西沙糖桔、广西皇帝柑中总黄酮含量均较高，其中广西沙糖桔多甲基黄酮总含量高达11.59 mg/g，果皮中多甲基黄酮总含量最少的品种是台州蜜桔（1.11 mg/g）；广西沙糖桔和浦江美人桔中甜橙黄酮含量较高，分别达到0.94 mg/g和1.51 mg/g；重庆柑橘、浦江美人桔、广东皇帝柑、广西沙糖桔、广西皇帝柑中川陈皮素相对含量较高（含量范围2.54 mg/g～6.85 mg/g），其中广西沙糖桔果皮中川陈皮素含量达到6.85 mg/g；重庆柑橘、广东皇帝柑、广西沙糖桔和广西皇帝柑中橘皮素含量较高（含量范围1.91 mg/g～3.38 mg/g），其中广西沙糖桔果皮中橘皮素含量达到3.38 mg/g；重庆柑橘、浦江美人桔、广东皇帝柑和广西皇帝柑中5-去甲基川陈皮素含量较高（含量范围 0.59 mg/g～0.80 mg/g）；另外，5-去甲基陈皮素在所检测的所有品种柑橘果皮中含量均极低，大部分品种的柑橘果皮中都未检出5-去甲基陈皮素。

表3 不同品种柑橘果皮中6种PMFs含量Table 3 Contents of six PMFs in different varieties of citrus peel

3 结论

本研究采用乙醇索氏提取结合高效液相色谱，建立了分离检测6种主要多甲氧基黄酮含量的方法。该方法简便、准确为柑橘果皮中多甲氧基黄酮的质量检测及陈皮中药材的制备及质量控制提供了参考方法和科学依据，同时也为其他天然产物同类化合物的研究提供了思路借鉴。