大泡技术辅助下深板层角膜移植术治疗犬角膜损伤的术式探讨

贺然，胥辉豪，朱慧媛

（西南大学动物科学学院，重庆 荣昌 402460）

板层角膜移植术是临床上常用的角膜移植术之一，而深板层角膜移植术（DLK）对于病灶较深且药物难以控制的角膜疾病更具有重要意义。DLK是一种完全去除病变角膜基质层组织，直至后弹力层暴露，再移植供体角膜组织的手术方法［1-2］。目前有多种DLK 手术方法，其中大泡技术在人医临床中的应用最为广泛。大泡技术通过向角膜基质内注射一定量的无菌空气后将后弹力层与基质层进行钝性分离，这不但可以最大程度地切削感染和病变的角膜基质［3］，而且还有效地解决了传统DLK 中暴露光滑的后弹力层及其破裂的问题，避免了各种风险和排斥反应。国内目前尚未有关于大泡技术应用于犬DLK 的研究及报道，因此本试验对该术式进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 试验动物 随机选择身体健康、双眼无病史的本地试验犬6 只及供体犬3 只，品种、性别不限，体重在10～15 kg 之间。编号分别为试验犬1、试验犬2、试验犬3、试验犬4、试验犬5、试验犬6，分别置于单独的经严格消毒的房间饲养，饲喂商品狗粮和饮水，每日两次，定期驱虫，保持圈舍干净和通风，1个月后进行试验。

1.2 角膜供体 角膜供体采用同种异体犬的新鲜角膜组织。

1.3 主要器材与设备 麻醉咽喉镜、眼科手术显微镜、眼科显微手术器材、负压环钻、动物专用眼压计、动物专用泪液试纸、荧光素钠眼科检测试纸、KOWA手持式裂隙灯、散光盘等。

1.4 主要药品与试剂 妥布霉素滴眼液、妥布霉素地塞米松滴眼液、他克莫司滴眼液、荧光素钠、20%甘露醇注射液、0.9%氯化钠注射液、痛立定、聚维酮碘等。

1.5 方法

1.5.1 构建犬高危角膜碱烧伤模型 试验犬均选择左眼为术眼，右眼不做任何处理。按标准实验室操作配制1 mol/L 的NaOH 溶液，选择直径为6.0 mm的角膜环钻孔制备滤纸片，浸泡于所制备的NaOH 溶液中备用。试验犬全身麻醉，右侧卧保定，将滤纸片取出置于试验犬左眼的角膜中央处，给予碱烧伤60 s 后立即使用生理盐水反复冲洗5 min。

造模后各试验犬皮下注射痛立定，4 mg/kg，佩戴伊丽莎白脖圈，防止其乱抓造成继发性损伤，保持术眼清洁及周围环境清洁卫生，每日观察术眼情况。造模后每日测量试验犬的泪液值1次，每日早、中、晚测量眼压值共3次，造模后第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d对试验犬术眼进行荧光染色，观察术眼角膜发展情况，并详细记录数据及拍照。当角膜出现角膜深层实质性水肿、溃疡、浑浊呈瓷白色，瞳孔不可见时，视为造模成功。

1.5.2 术前准备 手术前准备常规手术室与手术器械，术前1 d 对各试验犬进行常规局部抗菌素点眼，使用0.5%左氧氟沙星滴眼液滴眼，3次/d，每次1 滴，防止术中感染。术前试验犬禁食禁饮12 h，建立静脉通道，术前15 min 对各试验犬皮下注射硫酸阿托品溶液（0.02 mg/kg），以抑制其呼吸道腺体分泌并稳定心率，利于手术的进行；使用丙泊酚注射液（4 mg/kg）静脉注射诱导麻醉，随后经行气管插管以建立呼吸通路，术中采用异氟烷吸入麻醉维持，并随时监测试验犬的心率、呼吸频率、血氧以及血压等生理指标。

1.5.3 大泡技术辅助下的DLK

1.5.3.1 供体准备 采用供体犬的新鲜角膜作为角膜供体：将3只健康的供体犬进行眼球摘除术，用PBS 液冲洗供体犬的眼球30 min，随后在手术显微镜下使用直径7.25 mm的环钻直接在供体犬的眼球上钻切角膜移植片，钻切深度约为角膜厚度的3/4，使用角膜板层刀对植片进行剥离，再将剪下的植片内皮面朝上置于无菌的培养皿内，注入足量粘弹剂以保持湿润，新鲜备用。共6 份角膜移植片，分别用于6只试验犬左侧术眼的移植。

1.5.3.2 植床准备 试验犬右侧卧保定，左侧术眼朝上，真空负压头枕调整术犬头部位置，5-0缝线固定试验犬术眼的上下直肌使得角膜水平朝上。定位试验犬眼睛的病变中心，使用7.0 mm负压环钻对角膜钻切约300 μm的深度后，用角膜板层刀小心切除浑浊、溃疡病变的角膜基质层，然后采用30 号穿刺针，使针头斜面向下，与角膜的顶点水平面呈10°～35°角度进行穿刺，针头缓慢推入后部角膜基质，当进入后部角膜基质后，快速注入无菌空气约1 mL，待无菌空气弥散，无菌空气弥散的力量将角膜后弹力层与基质层迅速分离，随即可见其角膜基质迅速变白，弥散后变为灰白色。如若在手术操作过程中一次穿刺的深度不足，可进行反复注气，直至角膜基质与后弹力层之间分层并形成明显的大气泡。术者左手持0.12 mm显微有齿镊向上轻轻提拉术眼的角膜基质，观察并确定角膜基质的下方有大气泡的存在之后，右手持一次性45°角膜板层刀继续向深层切削，将溃疡病变的角膜基质进一步切除，直至角膜基质由灰白色变为半透明状，当完全切透时，无菌空气便会迅速溢出，而后弹力层会贴附于后层的基质，再缓慢逐层切除，至角膜基质层下方的后弹力层暴露，形成一个光滑的剖切平面，此时植床制作完成。

1.5.3.3 缝合植片 将备用的供体角膜移植片取出，覆盖于制作好的植床上并固定，采用10-0 尼龙缝线首先在12、6、3、9 点进行缝合，然后在各自象限中均匀间断缝合，共16 针，缝针全层贯穿整个植片厚度，缝合完毕后在散光盘下观察术眼的角膜映光环，并根据其形状来调整尼龙缝线的松紧程度，直至角膜映光环呈现出相对比较规则的圆形后，再采用显微平镊将线结旋转入角膜植床的侧层间，避免后弹力层被划破，以减少术后一系列眼表刺激，并将角膜移植片压入植床边缘之下，使植床与角膜移植片对合相对紧密，或略低于植床面，这样有利于角膜上皮的愈合。

1.5.4 术后观察与治疗 将各试验犬独立饲养在安静的房间内，24 h佩戴伊丽莎白圈，观察术眼的症状及恢复情况，根据术眼的发展情况调整使用局部药物。术后使用痛立定用于缓解术后疼痛，局部滴妥布霉素滴眼液（托百士），6次/d，1滴/次；1 周后停用托百士，改滴妥布霉素地塞米松（典必殊），6 次/d，1 滴/次；术后2 周停用典必殊，改用他克莫司滴眼液，4 次/d，1 滴/次，持续使用，同时根据情况结合糖皮质激素冲击疗法控制排斥反应。

术后每日对术眼的分泌物情况进行观察，分别于术后第3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d 时，根据眼表裂隙灯的观察情况，对角膜的浑浊度情况、新生血管生长情况、水肿情况及荧光素钠染色情况进行评分，并进行眼内压测量和泪液量测量。

1.5.4.1 裂隙灯显微镜检查 使用开睑器开张术犬上下眼睑，使术眼正对裂隙灯镜头，在8倍镜视野下对其进行观察并拍照，同时对角膜的浑浊度、水肿、新生血管和荧光染色情况进行记录。参照Holland等［4］的方法对犬角膜新生血管、犬角膜水肿及犬角膜浑浊度进行评分，这三项指标的评分总和为角膜移植反应指数（RI），当RI≥5时，则说明发生了排斥反应。另外也可通过角膜荧光素钠染色法来观察角膜上皮的破损情况，以判断试验犬角膜的恢复情况。

（1）犬角膜新生血管情况：根据表1 进行计分。

表1 角膜新生血管的评分标准

（2）犬角膜水肿情况：根据表2进行计分。

表2 角膜水肿的评分标准

表3 角膜浑浊度的评分标准

（3）犬角膜浑浊度情况：根据表3进行计分。

（4）犬角膜上皮缺损情况（荧光素钠染色）：将各术犬的术眼角膜水平均分为上、中、下三个不同的区域，将荧光素钠均匀涂布于角膜进行染色，然后在裂隙灯钴蓝光下观察这三个区域的染色情况，正常角膜不显色而角膜异常者会显色。根据表4 进行记分，将三个区的得分相加得到总的染色评分，分值越高表明角膜生长愈合情况越不良。

表4 角膜分区荧光素钠染色的评分标准

1.5.4.2 犬眼压的测量 术后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d测量各试验犬的眼压值。测量步骤如下：保定术犬的头部，使其为站立位或坐立位，开张上下眼睑，暴露眼球，测量人员右手持回弹式眼压计，进行眼压测量，根据眼压计显示的数据直接读取，每次回弹6 次最终生成一个数值，取3 次数值的平均值为最终眼压结果。犬眼压正常范围为15～25 mmHg。

1.5.4.3 犬泪液量的测量 术后3d、7d、14d、21d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d测量各试验犬的泪液值。测量步骤如下：

在术犬清醒状态下，保定试验犬的头部，使其为站立位或坐立位，将泪液试纸条放入下眼睑中部到外侧1/3 处的结膜囊内，然后尽量保持犬头部固定、可自由眨眼，1 min 后读取并记录试纸上被泪液浸染过的刻度值，即为泪液分泌量。泪液量若低于15 mm/min，视为异常。

2 结果

2.1 犬高危角膜碱烧伤模型观察结果 造模前试验犬角膜正常，透明，虹膜纹理清晰可见，表面光滑；造模后第1 d，角膜可见边界清晰的瓷白色病灶；造模后第5 d，术眼泪液量大，分泌物多，角膜开始水肿，有溃疡形成；造模第11 d，角膜浑浊和水肿情况进一步加重，溃疡进一步发展；造模15 d后，角膜中心及边缘开始出现少许新生血管，犬角膜出现完全深层实质水肿，溃疡更为明显，浑浊进一步加重，瞳孔模糊，虹膜质地、纹理不清等。角膜重度碱烧伤模型建立成功。随后即行大泡技术辅助的深板层角膜移植术。

2.2 大泡技术辅助下的DLK 手术过程 如图1所示：定位试验犬眼睛的病变中心后，采用7.0 mm 负压环钻对角膜钻切，用角膜板层刀将前部病变的角膜基质切除（图1A、B）；然后使用30 号针头，使其斜面向下，向角膜基质内刺入，并迅速注入无菌空气，可以看到角膜基质迅速弥散变为灰白色（图1C、D）；然后在显微有齿镊的辅助下，用45°角膜板层刀继续切除溃疡病变的基质（图1E），直至变为透明状，后弹力层完全暴露，植床建立完成（图1F）；将备好的供体角膜移植片取出覆盖于建立好的植床上，使用10-0尼龙线进行间断结节缝合共16针（图1G、H）。

2.3 术后犬角膜情况 术后一个月内，犬术眼水肿，分泌物较多，边缘模糊，角膜基质较水肿，浑浊程度随时间延长逐渐减轻；术后42 d，角膜移植片稍浑浊，分泌物进一步减少；术后63 d，角膜移植片恢复透明，并且与植床贴附良好。

2.4 裂隙灯显微镜检查

2.4.1 角膜眼表评分 对犬角膜新生血管、犬角膜水肿及犬角膜浑浊度三个项目进行评分并记录，取6只试验犬的各项平均值进行观察分析，结果显示：试验犬在术后一周内角膜稍浑浊、水肿，一周后有所加重，且开始长出新生血管，发生了轻微的排斥反应；42 d 后，角膜水肿程度、浑浊程度有所减轻，新生血管的生长逐渐被抑制；此后角膜移植反应指数＜5，说明各试验犬角膜生长愈合情况令人满意，恢复良好。

2.4.2 试验犬角膜上皮缺损情况 对犬角膜进行荧光素钠染色后，对染色点的数量进行评分，术后一个月内，试验犬角膜的染色点较为散在，数量较多，总分处于较高水平。术后一个月后，染色点总体减少，染色总分逐渐降低，维持在较低水平，恢复较为良好。

6只试验犬角膜上皮缺损评分的平均值如图2所示。

2.5 术后试验犬眼压测量结果 术后对试验犬进行眼内压测量，取6 只试验犬的平均值进行观察分析（如图3）。术后21 d 内，各犬眼压维持在较低的状态，总体呈上升趋势；此后眼压逐渐上升，术后21 d恢复到正常范围内。

图1 大泡技术辅助下的深板层角膜移植术过程

图2 术后试验犬角膜上皮缺损评分

图3 术后试验犬眼压测量结果

2.6 术后犬泪液量测量结果 取6 只试验犬的平均值进行观察分析（如图4）。术后一周内，泪液量持续降低，泪液量较少但仍在正常范围内。使用滴眼液后，泪液量明显上升，持续使用，泪液量维持在较稳定的状态。

图4 术后试验犬泪液量测量结果

3 讨论

进行大泡技术辅助下的DLK时应注意，供体角膜的直径应比制作的植床的直径大0.25～0.5 mm，保证覆盖均匀，植片与植床对接缝合紧密。钻切植床时，环钻与角膜面要尽量保持垂直状态，以保证钻取的深度和角度达到理想要求，有利于术后愈合。在进行无菌空气注入形成大气泡来分离后弹力层这一手术步骤时，术者应掌握好穿刺的力度与角度，将穿刺针头弯曲后再斜向下注入空气，若针头透过后弹力层进入前房则手术失败。在向角膜后部基质注入无菌空气的过程中，有少许小气泡进入前房，考虑气体量较少，不影响手术过程以及术后的恢复，暂可不做处理，由其自行吸收消散。本试验中，6只试验犬都成功接受了大泡技术辅助下的DLK，术后犬角膜透明度恢复正常，证明了该术式的有效性。

术后21 d 内试验犬的角膜反应指数（RI）逐渐增大，稍微超出正常范围，35 d 后逐渐下降，发生了轻微的移植排斥反应，主要原因考虑为角膜的血管化使得异体抗原更容易呈递给受体免疫系统［5］，此外术后上皮缺损会产生损伤性的炎症反应。每日对试验犬进行眼压值和泪液量的测量，结果眼压稳定在15～25 mmHg，泪液分泌量稳定在18～22 mm/min，均处于正常范围。这进一步验证了大泡技术辅助下的DLK 对犬角膜损伤疾病的临床疗效较好。

综上所述，大泡技术辅助下的DLK应用于犬角膜溃疡疾病的手术方法是可行的，且过程安全有效，临床效果较佳，但相关细节仍可进一步完善。该项技术可作为犬角膜溃疡等角膜损伤性疾病的理想治疗手段。