利用分子标记辅助选育优质长粒香型软米水稻新品系“上师大19 号”

胡 兰，孙双燕，曹伟召，曾文秀，赵国超，李建粤∗

(1 上海师范大学生命科学院，上海200234；2 上海上实现代农业开发有限公司，上海202183)

胡兰，孙双燕，曹伟召，等.利用分子标记辅助选育优质长粒香型软米水稻新品系“上师大19 号”[J].上海农业学报，2020，36(4)：1-5

近年来，改善稻米食味品质研究已越来越受到重视。 优质食味品质稻米具有较低直链淀粉含量(AC)、较高胶稠度(GC)以及较低糊化温度(GT)[1-3]等优点。 有报道认为，蜡质基因(Waxy，Wx)通过编码结合于淀粉粒上的淀粉合成酶(Granuale bound starch synthase，GBSS)控制直链淀粉合成，是影响稻米食味品质最重要的基因[4]。 Tian 等[5]进一步研究发现，蜡质基因是影响稻米直链淀粉合成和胶稠度指标的主效基因，同时对稻米糊化温度也有微效影响。

软米是一种米质介于糯米与黏米之间的优质米，直链淀粉含量较低[6]。 胡大明等[7]报道显示，香型水稻‘青香软粳’稻米直链淀粉含量为9.3%，属于软米类品种。 李凌等[8]研究发现，‘青香软粳’水稻蜡质基因在第4 外显子上碱基G 突变为A，由此可能降低了稻米直链淀粉的合成。 由上海市松江区农业技术推广中心选育的香型水稻‘1013’(‘松早香1 号’)具有与‘青香软粳’水稻相同的软米基因[9]。 软米因具有独特的烹饪和食用品质，如味甜、软糯，米饭冷后不变硬，适于煮饭与熬粥，受到很多消费者的青睐。

香米是指具有特殊香味的稻米。 香味基因位于水稻第8 号染色体上，其编码甜菜碱醛脱氢酶2(BADH2)[10]。 消费者同样喜爱香型稻米。 香稻育种一直是育种家们非常重视的育种方向。

‘嘉禾218’属于长粒型水稻品种，粒型似‘泰国香米’，其稻米外观晶莹透明，商品性能好[11]。 2009年，‘嘉禾218’被上海市青浦区引进种植，表现出综合抗性较好、产量高、熟期较早、适应性广等特点[12]。尽管‘嘉禾218’前几年在浙江省和上海市试种中都具有较好的表现，但是‘嘉禾218’稻米既不香，也不属于软米类型，与目前市场需求的香软类型水稻存在一定的差距。 本研究以‘松早香1 号’为香味基因和软米基因的供体亲本，以‘嘉禾218’为转育亲本进行杂交、回交及自交，结合分子标记辅助选育长粒型的香型软米水稻新品系“上师大19 号”，并对选育的“上师大19 号”水稻进行试种，考察农艺性状、产量性状，分析稻米品质，以期为在上海地区推广长粒型的香型软米水稻提供依据。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

亲本水稻材料‘嘉禾218’和‘松早香1 号’分别由上海长禾农业发展有限公司高磊经理和上海市农业技术推广服务中心沈嘉清研究员惠赠。 2004 年和2005 年，‘嘉禾218’水稻在浙江省嘉兴市参加水稻品种区域试验，全生育期155 d，平均株高92.3 cm，112.5 粒∕穗，结实率86.3 %，千粒重29.2 g，产量分别为8 034 kg∕hm2和7 558.5 kg∕hm2[13]。 2017 年‘松早香1 号’在青浦区试种产量为6 720 kg∕hm2，米质综合评价好[14]。

1.2 “上师大19 号”水稻的选育

2012 年3 月在海南，以‘嘉禾218’水稻为母本，以‘1013’(即‘松早香1 号’)水稻为父本进行杂交，4 月收获F1种子。 同年5 月在上海种植F1种子，9 月以‘嘉禾218’为母本、F1植株为父本进行回交并收获BC1F1种子。 2012 年12 月至2013 年10 月，分别在海南和上海，继续以‘嘉禾218’为母本，再连续回交2 代得到BC3F1种子。 在每一代回交前，都要对回交植株进行农艺性状和颖壳性状考察，选取农艺性状较好并且长粒型的单株，进行香味基因和软米基因检测，将同时具有两个目标基因的植株作为继续回交的父本。

2014 年4 月在海南收获BC3F2种子，于5 月在上海进行大量种植，9 月观察植株开花时期和农艺性状，选取开花时期和籽粒长度接近‘嘉禾218’、株型较好的植株，取叶片再进行两个目标基因检测。 10 月底收获两个目标基因都纯合的BC3F3种子。 2014 年12 在海南继续扩繁两个目标基因都纯合单株的种子，2015 年4 月从各项性状都一致的小区中混收种子，同时取单株收获种子。

1.3 香味基因和软米基因分子标记检测

采用CTAB 法提取水稻植株叶片DNA。 香味基因和软米基因检测方法分别参照许言福等[15]和谢米雪等[9]的报道。 PCR 扩增香味基因的上下游引物序列分别为：CAGCGGCAGCTCTTCGTCGC(C2-F)和CAGCCATGCTTCCAACTTATTCC(C2-R)；PCR 扩增软米基因的上下游引物序列分别为：AGCGTTGTGGCTGAGGTAGG(Wx-F)和TGAAGTATGGGTTGTTGTTGAG(Wx-R)。

在两种分子标记检测中，酶切产物均使用2% 琼脂糖凝胶进行电泳检测分析，电压120 V，时间40 min。

1.4 农艺性状和产量性状分析

“上师大19 号”水稻于2016 年5 月在上海上实现代农业开发有限公司进行试种。 试种面积13.34 m2，3 个重复，记录农艺性状和产量性状。

2017 年5 月在上海师范大学闵行基地试种“上师大19 号”水稻，株行距为15 cm ×20 cm。 水稻成熟时，在面积约为3 m2的小区中间随机选取5 棵单株，记录农艺性状和产量性状，并进行统计分析。

1.5 稻米品质指标分析

“上师大19 号”水稻稻谷品质由农业部稻米及制品质量监督及检验测试中心进行检测。

2 结果与分析

2.1 香味基因和软米基因的检测

2.1.1 香味基因的检测

本课题组曾检测‘松早香1 号’水稻甜菜碱醛脱氢酶2 基因，发现其含有第二外显子突变类型的香味基因(badh2-E2)(未报道)。 根据badh2-E2 与非香基因Badh2 在+310 bp 位点脱氧核苷酸的差异性，采用CAPS(EheⅠ)分子标记对回交及自交后代进行香味基因检测[15]。

对于回交植株，PCR 产物经EheⅠ酶切后电泳，会出现同时具有292 bp 和375 bp 两条带，以及同时具有292 bp、375 bp 和667 bp 三条带的两种带型(图1)。 两种带型分别对应无香味基因和香味基因呈杂合状态。 在进行回交时，选取具有292 bp、375 bp 和667 bp 三条带的单株作为父本。

对于BC3F2自交植株，PCR 产物经EheⅠ酶切后电泳，会出现三种带型：只有667 bp 一条带、同时具有292 bp 和375 bp 两条带、同时具有292 bp、375 bp 和667 bp 三条带(图2)。 三种带型分别对应纯合香味基因、无香味基因和香味基因呈杂合状态。 在BC3F2自交植株检测时，保留只有667 bp 一条带，即香味基因呈纯合状态的植株。

2.1.2 软米基因的检测

根据谢米雪等[9]在Wx基因第4 外显子+693 bp 处G∕A 碱基差异建立的CAPS(NlaⅢ)分子标记，对回交和自交植株进行软米基因鉴定。Wx基因的PCR 产物经NlaⅢ酶切后，同时具有380 bp 和177 bp 两条带属于纯合软米基因型，如果只有一条557 bp 条带说明是无软米基因，同时具有557 bp、380 bp 和177 bp三条带表明软米基因为杂合状态。

检测回交植株，电泳显示有两种带型：只有557 bp 一条带和同时具有557 bp、380 bp、177 bp 三条带(图3)。 在回交操作中，选取同时具有557 bp、380 bp、177 bp 三条带的植株作为回交父本。

对BC3F2自交植株检测，电泳显示有三种带型：只有557 bp 一条带、同时具有380 bp 和177 bp 两条带、同时具有557 bp、380 bp、177 bp 三条带(图4)。 在BC3F2自交植株检测中，保留同时具有380 bp 和177 bp 两条带，即软米基因呈纯合的植株。

2.2 农艺性状和产量性状考察

2016 年，“上师大19 号”水稻在上海上实现代农业开发有限公司崇明东滩试种，5 月20 日播种，6 月17 日移栽，9 月4 日开花，10 月23 日成熟，全生育期156 d。 农艺性状和产量性状考察显示，每667 m2高峰苗数23.63 万，有效穗数19.63 万，成穗率83.1%，株高91.45 cm，穗长20.0 cm。 “上师大19 号”水稻每穗总粒数120.2 粒，每穗实粒数106.4 粒，结实率88.50%，稻谷千粒重30.30 g。 三个小区测产，“上师大19 号”水稻实际产量平均为8 234.4 kg∕hm2。 “上师大19 号”水稻对叶瘟、穗茎瘟和白叶枯病均具有较强的抗性，病情指数均为0，但略感纹枯病，病情指数为1.24。

2017 年5 月22 日在上海市闵行区播种“上师大19 号”，6 月18 日人工插秧。 “上师大19 号”水稻在9 月5 开花，10 月下旬成熟，总生育期约157 d。 水稻株高平均为97.4 cm，单株平均有效穗数9.2 个，平均每穗实粒数80.8 粒，结实率87.01%，千粒重29.07 g，单株重26.31 g。 根据株行距为15 cm ×20 cm 折算，推测“上师大19 号”水稻理论产量为8 774.4 kg∕hm2。

2.3 稻米品质指标分析

经农业部稻米及制品质量监督及检验测试中心检测，“上师大19 号”水稻糙米率为83.2%，精米率为75.0%，整精米率为65.6%，粒长7.2 mm，长宽比3.1，垩白率20%，垩白度1.7%，透明度1 级，碱消值7.0 级，胶稠度72 mm，直链淀粉含量8.0%，蛋白质含量8.3%。

3 讨论

‘泰国香米’在国内有较大影响力，历来受到上海市民的欢迎。 由于受‘泰国香米’粒型的影响，长粒型稻米的市场竞争力也相对较高。 对于水稻两大亚种，粳稻的蒸煮食味品质一般好于籼稻，粒型大多为短圆型。 虽然籼稻食味品质不如粳稻，但籼稻粒型大多为长粒型，外观品质大多好于粳稻。 在粳稻品种选育中，对长粒型遗传种质的选择，已经成为近年来一种趋势[16]。

目前，长粒型粳稻代表品种有‘嘉禾218’。 本研究以‘嘉禾218’水稻作为回交亲本选育出“上师大19 号”水稻，其农艺性状及全生育期与‘嘉禾218’水稻接近。 据浙江省嘉兴市农业科学院等单位在2005年和2006 年试种‘嘉禾218’水稻发现，‘嘉禾218’平均叶瘟0.25 级，穗瘟2.75 级，穗瘟损失率4.05%、白叶枯病7.0 级[11]。 本研究选育的“上师大19 号”水稻对叶瘟、穗茎瘟和白叶枯病都具有较强的抗性，病情指数均为0，但略感纹枯病，病情指数为1.24。

黄海祥等[11]和韩娟英等[17]报道，‘嘉禾218’水稻高抗条纹叶枯病。 本课题组曾采用许言福等[18]和王英存等[19]方法分析‘嘉禾218’水稻基因组DNA，发现‘嘉禾218’水稻含有条纹叶枯病抗性基因qSTV11KAS(未报道)。 本研究选育的“上师大19 号”水稻也含有与‘嘉禾218’水稻相同的条纹叶枯病抗性基因qSTV11KAS。 Zhang 等[20]报道认为，含有qSTV11KAS基因的水稻对条纹叶枯病具有较强抗性。 尽管本研究没有对“上师大19 号”水稻进行抗条纹叶枯病性状考察，但从其含有与‘嘉禾218’水稻相同的条纹叶枯病抗性基因qSTV11KAS推测，“上师大19 号”水稻在生产中也将会表现出较好的抗条纹叶枯病特性。

前些年有文献报道‘嘉禾218’水稻的稻谷品质[11，17，21]。 与‘嘉禾218’水稻比较，本研究选育的“上师大19 号”水稻垩白率和垩白度比‘嘉禾218’水稻略高些，但整精米率高于‘嘉禾218’水稻，并且稻米直链淀粉含量仅为8.0%，已明显低于‘嘉禾218’水稻，达到了软米程度。 “上师大19 号”水稻稻谷其他品质指标与‘嘉禾218’水稻接近。

依据国际水稻研究所的标准，长宽比大于3.0 者即为细长型。 我国优质籼米的新标准是长宽比大于2.8。 长宽比大于2.5，整精米粒长≥6.5 mm 即为长粒粳稻[16]。 “上师大19 号”水稻粒长为7.2 mm，长宽比为3.1，粒型与‘嘉禾218’水稻相似，但稻米直链淀粉含量仅为8.0%，因此，“上师大19 号”水稻属于长粒型的香型软米。

目前，上海市及周边地区推广种植的香型软米水稻都属于短粒型的，如上海市种植面积较大的‘青香软粳’水稻。 胡大明等[7]在2010—2013 年考察了‘青香软粳’水稻的外观品质，发现‘青香软粳’稻米垩白率和垩白度平均值分别为54.25%和12.23%。 从垩白率和垩白度检测结果显示，“上师大19 号”稻米外观品质明显好于‘青香软粳’水稻。 “上师大19 号”水稻的成功选育，为进一步开发外观较好的香型软米水稻奠定了基础。