樊艳爽 唐亚丽
摘要:枯草芽孢杆菌具有代时短,抗逆性强,安全高效,无致病性的优点,广泛应用于各个领域。本文针对枯草芽孢杆菌的应用专利进行统计分析,包括专利申请量趋势、申请人类型分析以及重点应用领域成果概况,旨在为我国微生物研究应用的发展提供参考。
关键词:枯草芽孢杆菌;发酵;专利技术;
中图分类号:G306;TQ925.2文献标识码:A 文章编号:1003-5168(2020)12-0109-04
1 枯草芽孢杆菌的简介
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类革兰氏阳性、好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌,广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的表面,为芽孢杆菌科(Bacillaceae)的模式菌株。自18世纪发现枯草芽孢杆菌以来,其发展历经100多年。国内外研究者们的早期大部分工作集中在枯草芽孢杆菌的形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面[1],随着对此菌性能进行的系统性的研究,该过程积累了丰富的研究资料。
由于该菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点,并可以分泌多种酶和抗生素,而且还具有良好的发酵基础,基于上述特点,使得枯草芽孢杆菌用途十分广泛[2],其应用主要集中于医药、食品、农业、环保等领域,并具体涉及到发酵产酶、食品发酵、农作物病虫害防治与促生长、畜牧和水产养殖业、环境修复等方面。随着对枯草芽孢杆菌的深入研究,枯草芽孢杆菌在现代科学研究中也体现出很高的应用价值,例如近年来,对枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域,研究内容具体体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等。
2 枯草芽孢杆菌的专利申请分析
针对枯草芽孢杆菌的研究和应用进展,本文以枯草芽孢杆菌分别与酶、医药、饲料、生防、农药、水处理、基因等作为主要关键词在CNABS(中国专利文摘数据库)和DWPI(德温特世界专利数据库)进行检索;本文专利数据库检索时限截止于2019年12月。
图1显示了从2000年至2019年涉及的枯草芽孢杆菌在发酵产酶、医药、饲料等领域的专利申请量的发展趋势。从图1可以看出,从2000年至2017年枯草芽孢杆菌的发展整体处于稳步增长的趋势,其中2012年至2013年的增幅最大,2000年至2006年处于缓慢发展阶段。由于枯草芽孢杆菌的安全、环境兼容性好和不易产生抗药性等优点,满足了现代社会对农业生产及有害生物综合防治的要求,在现代生物技术领域得到广泛应用;但是,发展总会伴随着新的突破,从宏观到微观的研究,从常规的应用到基因组和蛋白质组学方面的研究还有待进一步深入,产业开发也有待进一步加强。
关于枯草芽孢杆菌的中国专利申请,其申请人类型的分布参见图2。其中,企业的专利申请量遥遥领先,大专院校的申请量次之,个人名义申请的专利数量也不容小视,科研单位的申请量较少。可见,枯草芽孢杆菌的实际工业研究应用较多,科研单位的专利申请量不多。
枯草芽孢杆菌现已广泛应用于各个领域,各个领域的申请量如图3所示。其中,涉及利用枯草芽孢杆菌发酵产酶的应用申请量较多;枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌,在遗传学和分子生物学中的研究应用的申请量次之。随着绿色生物技术的发展,人们对安全性和生物资源利用度的关注,采用枯草芽孢杆菌发酵制备饲料、肥料的申请量也较高。而对于生防菌株和水处理的应用较其他领域较少。
3 枯草芽孢杆菌在不同领域的应用分析
经检索和初步阅读后,对检索到的专利申请按照应用的领域进行分类,主要分为4方面:发酵、农业、环境处理、分子生物学等。
3.1 枯草芽孢杆菌在发酵产酶中的应用
研究资料表明,枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。成都地奥九泓制药厂的发明专利CN 101316608B涉及一种枯草芽孢杆菌DIAO 1502(保藏编号为CCTCC NO:M204092)新菌株及其在制备血栓疾病药物中的用途,将培养后的菌株作为发酵用種子液,并使用该种子液经液态发酵或固态发酵得到纳豆激酶,并将所述纳豆激酶用于制备治疗血栓疾病药物。该发明的枯草芽孢杆菌新菌株,产酶率高,为工业化生产纳豆激酶药物制剂提供了新的途径。山东科隆特酶制剂有限公司的发明专利CN105176883B涉及一种产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌,该菌株发酵酶活力高,可广泛应用于啤酒、酒精、发酵工业的液化等行业;青岛蔚蓝生物集团有限公司的发明专利CN103789227B涉及一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌,在去污效果方面,该菌株所产的碱性蛋白酶优于市场上的碱性蛋白酶。HANKYU BIOINDUSTRY 公司的发明专利JP2001069975A公开了一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌,获得壳聚糖酶能够有效的降低胆固醇、改善血糖水平和抑菌等;KOTTWITZ BEATRIX公司的发明专利EP1385943B1公开了一种衍生自枯草芽孢杆菌蛋白酶的新型碱性蛋白酶变体,该蛋白酶变体能够用于洗涤剂和清洁剂;诺维信公司的发明专利EP1389228B1公开了一种洗涤剂组合物,该组合物包含表面活性剂和果胶酸裂解酶,所述果胶酸裂解酶由枯草芽孢杆菌菌株的内源DNA序列编码。
3.2 枯草芽孢杆菌在农业生产中的应用
枯草芽孢杆菌在农业中的应用主要体现在其能够应用于农作物病虫害防治、农作物促生长剂、畜牧和水产养殖业的微生物添加剂(饲料添加剂)、养殖环境净化剂、防治畜禽疾病等方面。中国农业科学院植物保护研究所的发明专利CN100404664C公开了一种作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株,该菌株能够抑制青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的生长,生防实验表明能够防治烟草青枯病;烟台绿云生物工程研究院有限公司的发明专利CN100352915C公开了一种新的枯草芽孢杆菌,使用该枯草芽孢杆菌通过发酵制备的微生态可以治疗并预防条件致病菌引起的各种疾病,制剂既能够与抗生素和化学制剂共同使用,降低抗生素和化学制剂的副作用,同时对耐药性菌株引起的疾病有较好的治疗效果,而且使用本制剂也可以防止致病菌的扩散,提高畜禽的自然免疫性;其同样也是一种可以替代抗生素、无药残、无污染、疗效高、安全型的微生态制剂;AMBROSOV VALERIJ ANTONOVICH公司的RU 2094990 C1发明专利涉及一株枯草芽孢杆菌菌株VKPM B-6554,该菌株能够作为抗真菌制剂,如抵抗白僵菌、黄萎病菌、核盘菌等;汉森公司的发明专利WO 2018167171A1的枯草芽孢杆菌,该菌株可以作为饲料添加剂饲喂动物,能够增加动物体重、降低坏死性肠炎病变等。
3.3 枯草芽孢杆菌在水处理中的应用
枯草芽孢杆菌吸附多种有害物或能够分泌多种生物絮凝剂,因此,其在水处理和污染水治理方面也有十分广泛的应用。建设部水处理新技术产业化基地的发明专利CN102533590B公开了一种低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌CGMCC No.5280,该菌株在低温下,特别是在8-12℃的条件下,对磷去除有明显的强化作用,磷去除率提高了10%,优于一级A的出水标准(水温≤12℃时,一级A标准的控制指标为0.5mg/L)。山西大学的发明专利CN102628066B公开了一种微生物絮凝剂的制备方法。该发明将枯草芽孢杆菌进行有氧扩大培养,将发酵液过滤,上清液减压蒸发浓缩,得到发酵浓缩液,提取并干燥,得到微生物絮凝剂;或将滤饼用海藻酸钠和聚乙烯醇固定化,制得固定化的微生物絮凝剂。该微生物絮凝剂能够用于水处理工艺中的水质软化,其对地下岩溶水的矿化度絮凝率达到36.92%左右,硬度絮凝率最大可达80.44%左右;KR20170050298 A涉及一种含有枯草芽孢杆菌的净化水质组合物,该组合物能够改善水质以达到长期净化功能;RU2617951C1涉及一株枯草芽孢桿菌SNBS-1,该菌株能够用于净化石油和石油产品污染的土壤和水。
3.4 枯草芽孢杆菌在遗传学与分子生物学中的应用
枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌,在遗传学和分子生物学中也有广泛的应用。江南大学的发明专利CN102925475B公开了利用一种新的转运信号来实现外源蛋白质的分泌表达的方法,具体是利用枯草芽孢杆菌分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸编码序列作为转运信号,分别与外源目的蛋白质(BgaB)的编码基因进行融合,构建能够融合表达重组蛋白的质粒,并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株,从而实现融合蛋白质的分泌表达;华南理工大学的发明专利CN107857802A涉及一种β-半乳糖苷酶高效分泌表达的信号肽,该信号肽能够实现外源基因的高表达,特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件;中国农业大学的发明专利CN107760655A涉及从枯草芽孢杆菌中分泌获得黄曲霉毒素降解酶BADE,然后进行体外克隆和原核表达,获得能够降解黄曲霉毒素的降解酶;天津大学的发明专利CN103627663B涉及采用进化工程与全基因组测序结合的方法,发现了三个有利于枯草芽孢杆菌利用木糖生长的基因突变,通过基因工程技术将点突变引入野生菌株,获得了能够利用木糖快速生长的重组枯草芽孢杆菌;花王株式会社的JP 4955358B2的发明专利公开了通过使枯草芽孢杆菌基因组的大区域缺失而获得的突变株,然后利用该突变株进行靶蛋白的表达。
4 结论与建议
通过对枯草芽孢杆菌的应用现状及其专利申请的分析,笔者对于当前基因治疗领域的发展态势有了宏观认识,并对主要应用领域进行了技术上的分析梳理。工业酶的生产依然是枯草芽孢杆菌应用的持续关注热点,其次以基因工程应用及农业生产方面的应用偏多,医药方面应用的专利研究相对薄弱。
枯草芽孢杆菌由于其自身含有丰富的产酶系统,具备生产多种酶的应用潜力,是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一,据不完全统计,枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50%,这与该领域的专利申请人以企业为主,偏向工业应用的研究趋势也是一致的。
我国酶制剂工业近年来取得了长足的发展,但其产业化应用暂不成熟,与世界同行业发展仍有差距。如医药方面,对具有治疗效果的酶制剂进行商品化开发并不多见,有待于进一步研究。在农业方面,一些相应的生物菌剂并未得到大范围推广应用,应缩短理论转化为应用的周期。另外,在科学研究方面,枯草芽孢杆菌也是研究的热点材料。开发利用基因工程菌以满足不同的应用需求,克服野生菌的不足也是未来的重点方向。
总之,中国科研院校和企业应该不断克服技术障碍,在有价值专利方面投入更多的技术研究,做好专利布局,在未来的微生物菌种的开发和应用中占据有利位置。创新与应用并重,对市场前景好的相关技术进行开发应用,加快科技转化,提升市场竞争力,实现产业可持续发展。
参考文献
[1] 惠明,窦丽娜,田青,候银臣.枯草芽孢杆菌的应用研究进展[J].安徽农业科学,2008(27):1623-6624,11627.
[2] 王晓阁.枯草芽孢杆菌研究进展与展望[J].中山大学研究生学刊(自然科学、医学版),2012(3):14-23.