孕妇血浆中游离胎儿DNA水平检测中表观遗传学方法的运用评价

董芳娟 郝宇卉 赵瑞丽

【摘 要】 目的：评价孕妇血浆中游离胎兒DNA水平检测中表观遗传学方法的运用价值。方法：采用回顾性方法分析，选取60例孕妇作为研究对象，根据孕期分为早期、中期及晚期，每组20例。同时选取20例非妊娠妇女为对照组，检测母体血浆中的游离DNA，比较各组Ct值。结果：对照组血浆中未检测到u-maspin，特异性为100.0%。其他三组孕妇血浆中均有u-maspin基因，敏感性高达95.0%。不同妊娠期孕妇的m-maspin基因表达水平无显著差异（P>0.05）。晚期妊娠组孕妇的△Ct、△△Ct均低于早期妊娠组、中期妊娠组，有显著差异（P<0.05）。晚期妊娠组孕妇的2-△△Ct与对照组相比，有显著差异（P<0.05）。结论：u-maspin基因可作为孕妇血浆中游离胎儿NDA水平变化的表观遗传学标志，可扩大非创伤性的产前诊断范围。

【关键词】 孕妇;游离胎儿;NDA;表观遗传学方法

文章编号：WHR2020044055

长期以来，产前获取胎儿组织样本的方法有绒毛膜取样、羊膜腔穿刺、脐带取血，具有创伤性，对胎儿、孕妇有一定危险[1-2]。随着现代生物技术的发展，发现母体循环中存在游离胎儿核酸，开创了非创伤性产前诊断的新纪元。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用回顾性方法分析，选取本院2018年9月至2019年9月收治的60例孕妇作为研究对象。纳入标准：1）均为单胎妊娠;2）签署知情同意书，自愿参与此次研究。排除标准：1）严重肝肾功能性疾病者;2）存在智力及认知障碍者或言语不利等有交流障碍者;3）受试者依从性差。根据孕期分为早期、中期及晚期，每组20例。同时选取20例非妊娠妇女为对照组，基本资料如下表1所示，各组年龄经统计学分析无显著差异，具有可比性（P>0.05）。

1.2 方法

所有受试者清晨均空腹抽取3mL静脉血，将其置入EDTA抗凝剂的试管中10min，按照3000r/min的速度离心15min，吸取上清置于无菌Ep管中，置于-80℃冰箱内保存待测。采用QLAGEN公司提供的DNA提取试剂盒，从血浆中提取DNA，严格按照说明书操作。所用引物序列及片段大小如下：基因m-maspin的引物序列（fprward）5′-TTATCGATTTTCGGTTTCGC-3′，扩增产物长度为98bp。

基因u-maspin的引物序列（fprward）5′-TTTATTATGAATTGGTTCGT-3′，扩增产物长度为98bp。基因β-actin的引物序列（fprward）5′-CTCTTATGCGCACGTATTC-3′，扩增产物长度为101bp。

1.3 观察指标

观察及比较不同组荧光定量PCR结果。

1.4 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，以P<0.05表明数据对比有显著差异。

2 结果

2.1 分析血浆中DNA的纯度

四组受试者标本的DNA纯度较高，A260/A280的比值在1.6～1.8。

2.2 普通PCR扩增目的基因及参照β-actin的琼脂糖电泳结果

根据所设计的引物，目的基因m-maspin、u-maspin的扩增产物长度均为98bp。其基因条带清晰，无引物二聚体，无杂带。

2.3 荧光定量PCR结果

对照组血浆中未检测到u-maspin，特异性为100.0%。其他三组孕妇血浆中均有u-maspin基因，敏感性高达95.0%。不同妊娠期孕妇的m-maspin基因表达，经统计学分析，无显著差异（P>0.05）。如下表2所示。但不同妊娠期孕妇的u-maspin基因表达水平，经统计学分析，有显著差异（P<0.05）。如下表3所示。

3 讨论

孕妇血液血环中胎儿NDA的存在形式主要有两种形式，第一种形式为游离在母体血浆或者血清中胎儿NDA，第二种形式为进入母体血循环中的胎儿完整细胞内。已有研究发现[3-4]：通过定量分析孕妇血浆与血清中胎儿的NDA，可检测出较高浓度的胎儿NDA，且浓度较相近。最早可见于妊娠7周查到，妊娠7～16周时，胎儿DNA水平较低，在妊娠24周后，胎儿NDA水平稳步提高，直至分娩达到高峰。孕妇血液中发现胎儿NDA开创了非侵入性的产前诊断途径，检测孕妇血液中胎儿NDA，可诊断出软骨发育不全、部分染色体易位等疾病。

长期以来，临床对孕妇外周血中游离胎儿核酸的应用多局限在检测胎儿及父亲一方，所检测的胎儿基因需与母亲NDA序列区分开来。Y染色体NDA序列是一种胎儿的特异性标志物，可有效区分胎儿与孕妇的NDA。而表观遗传学DNA甲基化技术，可突破母血中检测胎儿NDA技术的局限性，取得新进展。该技术拓宽了利用母体血浆中胎儿NDA来诊断胎儿疾病的应用范围[1]。此次数据调查显示，不同妊娠期孕妇的m-maspin基因表达无显著差异，但u-maspin表达有显著差异，表明u-maspin基因水平的升高与妊娠进展密切相关，可将其作为孕妇血浆中胎儿游离DNA水平变化的表观遗传学标志。

综上所述，u-maspin基因表达可作为表观遗传学标志，可扩大非创伤性产前诊断的应用范围。

参考文献

[1] 张玢，沈聪，王慧艳，等.孕妇外周血胎儿游离DNA无创产前检测失败原因的初步分析[J].中华医学遗传学杂志，2018，35（03）：329-333.

[2] 袁路，张富青，刘敏，等.胎儿游离DNA无创产前筛查11067例分析[J].医药论坛杂志，2019，02（05）：34-35.

[3] 胡振仪，朱清华.血清μE3βHCGhAFP联合无创DNA产前检测在胎儿染色体非整倍体产前筛查中的应用[J].浙江临床医学，2018，20（08）：678-679.

[4] 苏文霞.人类胚胎干细胞中表观遗传修饰与基因表达的相关研究[D].内蒙古：内蒙古大学，2016.