全蝎白术白头翁组方发酵前后可溶性蛋白质分子量分析

陶然　刘富菁　王娅玲　王悦　袁如月　宋兴爽　王集会

摘      要： 通过Tricine-SDS-PAGE电泳法比较全蝎白术白头翁组方发酵前后水溶性蛋白质相对分子量的变化。按照超声水提的最佳工艺，分别制备全蝎白术白头翁组方（SAPZF）、全蝎白术白头翁组方发酵物（SAPZFFW）的超声水提醇沉冻干粉。通过Tricine-SDS-PAGE电泳法对SAPZF、SAPZFFW醇沉物中的蛋白进行凝胶电泳分离。结果表明：12% T、3% C的Tricine-SDS-PAGE电泳图谱显示SAPZF醇沉物的蛋白主要出现了4个条带，相对分子量主要集中在130、70、50、35 kDa左右;SAPZFFW醇沉物的蛋白主要出现了3个条带，相对分子量分别集中在50、20、15 kDa左右。Tricine-SDS-PAGE电泳图谱显示发酵前后的全蝎白术白头翁中蛋白相对分子量大小具有显著性差别，发酵之后的蛋白质相对分子量较未发酵的变小。

关  键  词：全蝎;白术;白头翁;Tricine-SDS-PAGE电泳;发酵;水溶性蛋白质

中图分类号：R284.1           文献标识码： A     文章编号： 1671-0460（2020）07-1330-04

Analysis on Molecular Weight of Soluble Protein

of SAPZF Before and After Fermentation

TAO Ran a， LIU Fu-jing a， WANG Ya-ling a， WANG Rue a， YUAN-Ruyueb， SONG-Xingshuanga，WANG Ji-hui c

（a.School of Pharmacy;b.College of Traditional Chinese Medicine;c.Experimental Center，

Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355 ， China）

Abstract： The change of protein molecular weight of SAPZF lyophilized powder before and after fermentation was compared by Tricine-SDS-PAGE electrophoresis. According to the optimum process of ultrasonic water extraction， the SAPZF and SAPZFFW extract lyophilized powders were prepared， respectively. The alcohol-precipitated proteins in SAPZF， SAPZFFW were separated by Tricine-SDS-PAGE electrophoresis. The results showed that， under the condition of 12% T and 3% C， Tricine-SDS-PAGE electrophoresis map of SAPZF extract showed four bands of protein with 130，70，50，35 kDa; and Tricine-SDS-PAGE electrophoresis map of SAPZFFW extract showed three bands of protein with 50，20，15 kDa. The Tricine-SDS-PAGE electrophoresis map showed that the molecular weight of the protein was significantly different in the extract lyophilized powder of SAPZF and SAPZFFW.

Key words： Scorpio; Atractylodes macrocephala; Pulsatilla chinensis; Tricine-SDS-PAGE electrophoresis; Fermentation; Water soluble protein

全蝎白術白头翁组方（SAPZF）是以全蝎、白术、白头翁三种中药按等量混合组成的复方。前期研究，该组方具有抗肿瘤抗病毒的作用^[1]，且经发酵后的组方，其抗肿瘤抗病毒作用有明显的提高。球孢白僵菌（B. bassiana）是属于半知菌亚门（deuteromycotina）的昆虫病原真菌，该菌的次生代谢物质如白僵菌素和其他聚酮类物质具有抗癌、抗病毒等作用^[2]。相关研究表明^[3]，大分子蛋白物质能通过固体发酵技术降解为小分子肽类，具有降低中药毒性、提高中药药效的作用。利用球孢白僵菌双向固体发酵技术发酵本复方后，其水溶性蛋白质、水溶性氨基酸的含量升高，抗肿瘤、抗病毒效果增强^[4]。考虑其抗肿瘤作用的增强可能与发酵后的蛋白质成分的变化有关，采用 Tricine-SDS-PAGE电泳法对发酵前后全蝎白术白头翁中可溶性蛋白质的种类和相对分子量进行比较，为今后研究其抗肿瘤成分奠定基础。

1  仪器与试剂

1.1  仪器

DYCZ-24D 垂直电泳槽，北京六一生物科技有限公司;DYY-8B 型稳压稳流电泳仪，北京天创尚邦仪器设备有限公司; UV9100B型紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

1.2  试剂

N，N，N，N-四甲基乙二胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、三（羟甲基）甲基甘氨酸、三（羟甲基）氨基甲烷、、丙烯酰胺，均购自上海麦克林生化科技有限公司;15-130 kDa双色预染蛋白Marker，上海源叶生物科技有限公司。

1.3  药材

全蝎（ButhusmartensiiKarsch，均为野生成年蝎）;白头翁（Pycnonotussinensis）及白术（Atractylodes- macrocephalaKoidz），均鉴定为正品;全蝎白术白头翁组合发酵物，自制（批号：20181228）。

2  方法

2.1  SAPZFFW、SAPZF冻干粉的制备

将球孢白僵菌桃5活化菌种B.bassiana（Bals.）Vuill接种于115 ℃灭菌后的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基中，于25 ℃条件下培养7 d后稀释成浓度为1×10⁸ CFU/mL 孢子悬液^[5]。无菌状态下称取已经钴-60灭菌的白头翁、野生全蝎冻干粉、白术药材各5.00 g，用孢子悬液湿润，均匀搅拌。在适宜条件下发酵至菌丝长满。冷冻干燥，即得SAPZFFW。等量取3种中药混合均匀即得SAPZF，均低温密封保存。

2.2  SAPZF、SAPZFFW超声水提醇沉及醇沉物冻干粉的制备

精密称取SAPZFFW于锥形瓶中，按照最佳超声水提工艺^[4]条件，加入40倍体积蒸馏水，调节pH为11，40 ℃超声提取60 min（频率80 kHz，输入功率500 W），于4 ℃、4 000 r·min^-1下离心15 min，抽滤，重提后两次滤液合并，即得SAPZFP超声水提醇沉。加入无水乙醇至其浓度为80%，静置1 d。于4 ℃、4 000 r·min^-1下离心15 min，取沉淀物冷冻干燥，低温密封保存。SAPZF超声水提醇沉及醇沉物冻干粉按同样方法制得。

2.3  SAPZFFW、SAPZF水提醇沉冻干粉中蛋白质含量的测定

采用福林酚法^[6]测定SAPZFFW、SAPZF水提醇沉中水溶性总蛋白质的含量。配制0.2 mg?mL^-1的牛血清蛋白溶液，用移液枪移取溶液于试管中、用蒸馏水定容至1 mL，使其质量浓度分别为0、0.04、0.08、0.12 、0.16 、2 mg?mL^-1，在波长为650 nm下测定吸光度，绘制蛋白质的标准曲线。精密称取SAPZFFW、SAPZF各1.00 g，定容制100 mL的容量瓶中，用移液枪移取溶液稀释至适宜浓度，测定其水溶性蛋白质的含量。

2.4  Tricine-SDS-PAGE电泳

2.4.1  电泳溶液的配制^[7-9]

按表1进行电泳所需缓冲溶液的配制，其所用水均为哇哈哈纯净水。

2.4.2  SAPZFFW、SAPZF水提醇沉蛋白电泳样品的制备

精密称取“2.2”项制备的SAPZF、SAPZFFW醇沉物冻干粉各0.10 g于烧杯中，加入样品缓冲液充分溶解后，稀释至适宜浓度。为了使电泳条带清晰，将样品溶液置于 100 ℃水浴锅中密封加热5 min，在

3 000 r·min^-1条件下离心3 min，移取上清液用于电泳。

2.4.3  电泳胶的配制

配制下层分离胶，用移液枪移取娃哈哈纯净水9.9 mL和30%丙烯酰胺12 mL于烧杯中，混和均匀后移取分离胶缓冲液7.5 mL于烧杯中混合均匀，将配制溶液抽气3 min后，依次加入10% 过硫酸铵0.3 mL、10% SDS 0.3 mL、N，N，N，N-四甲基乙二胺12 μL，混合均匀。将制备好的分离胶用移液枪吸至凝胶板中至适宜位置，用胶头滴管加适量蒸馏水压平界面，静置1 h至蒸馏水与凝固的胶层分离，倾倒出蒸馏水并用滤纸吸尽。配制上层浓缩胶，用移液枪吸取娃哈哈纯净水6.80 mL和30%丙烯酰胺1.70 mL于烧杯中混合均匀，加入浓缩胶缓冲液

1.25 mL混合均勻，抽气3 min后，依次加入10%SDS 0.1 mL、10%过硫酸铵0.10 mL、N，N，N，N-四甲基乙二胺10 μL，混合均匀。将配置好的浓缩胶用移液枪吸至分离胶上部，嵌入干燥洁净的梳子，静置约1h至形成凝胶后，缓慢拔出梳子。用适量负极缓冲液冲洗上样孔后用吸水纸吸尽负极缓冲液。

2.4.4  电泳及凝胶的固定、染色、脱色

用微量注射器进样“2.4.2”项制备的样品溶液20.00 μL、Marker 5.00 μL，取下凝胶板立即放入电泳槽中并用夹子固定，加入阴极缓冲液和阳极缓冲液。用80 V恒压电泳至样品条带开始进入分离胶时，调节电压至120 V继续进行电泳。电泳结束后取出平板中的凝胶，浸泡于固定液（50%乙醇、10%冰乙酸、40%蒸馏水）中固定1 h，置于考马斯亮蓝R-250染色液中染色1 h后，用蒸馏水洗去凝胶表面的染色液，将凝胶置于脱色液（8%冰乙酸、25%乙醇、67%蒸馏水）中在摇床上脱色，并不断更换脱色液至凝胶上的背景颜色脱干净^[10]。Marker标准蛋白质的分子质量为130、100、70、50、35、25、20、15 kDa。

3  结果

3.1  SAPZFFW、SAPZF水提醇沉冻干粉中蛋白质含量

如图1所示，以吸光度为纵坐标，水溶性总蛋白质的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得水溶性总蛋白质的回归方程为y = 2.267 5x + 0.003 9，R ² = 0.998 4，在浓度范围0～02 mg·mL^-1内水溶性总蛋白质与吸光度的线性关系良好。 SAPZFFW和SAPZF中水溶性蛋白的含量分别为22.68%、10.48%。由此可见，组方经发酵后其水溶性蛋白质的含量有所增加。

3.2  SAPZFFW、SAPZF水提醇沉冻干粉中蛋白电泳比较

采用Tricine-SDS-PAGE电泳法电泳后，可见凝胶上SAPZFFW主要得到3条电泳条带，相对分子量主要集中在50、20、15 kDa左右，SAPZF主要可得到4条条带，相对分子量主要集中在130、70、50、35 kDa左右。由此可见，发酵后的全蝎白术白头翁组方中的蛋白质相对分子量明显降低。

4  结束语

通过使用真菌白僵菌对中药组方进行混合发酵可以将中药中的化学成分通过真菌生长过程中产生的范围广泛的酶系进行结构修饰和生物转化，从而产生出新的有效成分，如将大分子蛋白酶解成小分子肽类等。同时真菌在生长的过程中也会产生一些具有广泛生物活性的次生代谢物质，例如白僵菌素和聚酮类物质等。本文通过Tricine-SDS-PAGE电泳法，比较全蝎白术白头翁组方发酵前后水溶性蛋白质相对分子量变化。研究表明，SAPZF醇沉物的蛋白出现了4个条带，相对分子量主要集中在130、70、50、35 kDa;SAPZFFW醇沉物的蛋白出现了3个条带，相对分子量分别集中在50、20、15 kDa。通过球孢白僵菌发酵后的全蝎白术白头翁组方，其蛋白质的相对分子量明显减小。表明发酵使组方中的大分子蛋白质发生了生物转化，变成了相对分子量更小的多肽和寡肽。根据前期研究表明，发酵后的全蝎白术白头翁中的极性物质体外对HSV病毒^[1]、乳腺癌细胞株MCF-7^[11]均具有较好的抑制作用，其活性均优于未发酵物，两者具有显著性的差异，推测其抗病毒、抗肿瘤活性的增强正是来自于此。采用Tricine-SDS-PAGE电泳对蛋白相对分子量进行定性的方法简单可行，设备操作简便，可以为全蝎白术白头翁组方的鉴别等研究方面提供新的思路。

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基金项目：山东省重点研发计划（项目編号：2016GSF202003）;山东中医药大学大学生创新创业训练计划（项目编号：2019042）。

收稿日期：2020-02-21

作者简介：陶然（1999-），女，山东省济南市人，研究方向：中药学。E-mail：2573839853@qq.com。

通讯作者：王集会（1962-），男，正高级实验师，研究方向：虫类中药发酵及活性成分研究。E-mail：Wangjihui10@126.com。