水稻恶苗病菌对氟啶胺的敏感性及与其他杀菌剂的比较

潘 登，马甜甜，许江岩，王 宁，宋立妹，张军民，潘以楼∗

(1 句容市希望生物科技有限公司，句容212400；2句容市希望农业科技咨询服务中心，句容212400)

潘登，马甜甜，许江岩，等.水稻恶苗病菌对氟啶胺的敏感性及与其他杀菌剂的比较[J].上海农业学报，2020，36(4)：77-82

水稻恶苗病(Rice bakanae disease)是由镰刀菌[Fusarium verticillioidesNirenberg(F.fujikuroi)]引起的种传病害[1-3]，可造成10%—50%的产量损失[4-5]。 上世纪80 年代初，相继在长江流域稻区和东北稻区发生。 水稻恶苗病发生程度受环境因素的影响较大，与品种、育秧方式等也有较大关系[6-7]。 改旱育秧为水育秧、降低稻种催芽时温度或不经高温催芽等措施，可以减轻恶苗病的发生，但防治水稻恶苗病最有效的方法仍是种子化学药剂或生物制剂的拌种、浸种、包衣等处理措施[6]。 上世纪70 年代前，无机杀菌剂(有机汞、有机硫、石灰水、福尔马林等)是防治稻恶苗病的主要药剂，这些药剂安全性差，且易残留，已被多菌灵(MBC)等苯并咪唑类杀菌剂取代[8]。 上世纪90 年代，稻恶苗病菌对多菌灵产生了抗药性，多菌灵逐渐被咪鲜胺取代[9-10]。 目前，溴硝醇[11]、氰烯菌酯[12-13]、二硫氰基甲烷(浸种灵)[14]和壳聚糖[15]及生物制剂[16-17]对水稻恶苗病具有较好的防治效果，但生产上仍以咪鲜胺以及混剂作为防治稻恶苗病的主要制剂[18]。 但单一药剂的长期使用使稻恶苗病菌对咪鲜胺产生抗性，且抗性菌株的比例逐年上升[18-24]，且这些抗性菌株具有较高的适合度，可以在田间形成优势种群[8，24]。 因此，筛选新的杀菌剂用于水稻恶苗病的防治是目前面临的迫切问题。

氟啶胺(Fluazinam)是吡啶胺类(Pyridines)新型杀菌剂，通过抑制病原菌细胞线粒体膜内外电子传导，影响病菌能量合成，抑制病菌生长；其对植物病原真菌的菌丝生长、孢子形成和孢子萌发、侵入器官的形成、游动孢子释放等各个生长阶段均有较强的抑制作用，可用于防治苹果链格孢叶斑病、葡萄灰霉病、大豆灰霉病、小麦雪腐病、马铃薯晚疫病、大白菜根腐病、辣椒疫病等[25-27]。 室内测定和田间试验表明，氟啶胺对水稻恶苗病菌具有较强的抑菌活性，已将其应用于生产[28-29]，但F.verticillioides对其的抗药性风险如何，还未见报道。 本研究通过室内毒力测定，明确F.verticillioides对氟啶胺的敏感性及其敏感基线，并比较氟啶胺与生产上常用杀菌剂对F.verticillioides活性，以期为F.verticillioides对氟啶胺抗药性风险评估和抗药性检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

1998—2012 年，在江苏宜兴、常熟、张家港、如东、如皋、泰兴、句容市(县)和上海市奉贤、金山、崇明区采集水稻恶苗病病株，用纸袋装好带回实验室。 采集病株的稻田未使用过氟啶胺。 病株用清水反复冲洗，置于培养皿中保温3—4 d，挑取病株上的霉层置于马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基上，每1 病株作为1个菌株，编号。 将菌株进行单孢分离[30]，按Summerell 等[31]方法进行鉴定，确定为F.verticillioides的菌株转入PSA 斜面上，保存于4 ℃冰箱中，每6—7 月转管1 次。 随机选择几个菌株从斜面转接到PSA 平皿，备用。

1.2 供试药剂

98%氟啶胺(Fluazinam)原药，浙江禾田化工有限公司；96%多菌灵(Carbendazim)原药，上海升联化工有限公司；95.3%戊唑醇(Tebuconazole)原药，盐城利民化工有限公司；95%氰烯菌酯(Phenamacril)原药，江苏省农药研究所股份有限公司；97%咪鲜胺(Prochloraz)原药，江苏辉丰农化股份有限公司；99%二硫氰基甲烷(Diisothiocyanatomethane)原药，南京农业大学植保学院农药系提供；30%氟菌唑(Triflumizole)可湿性粉剂，日本曹达株式会社生产，市售。

多菌灵等供试原药按文献[32]的方法配制成2 000 μg∕mL 的母液。 30%氟菌唑可湿性粉剂用灭菌水溶解成2 000 μg∕mL 母液。 在药剂母液中加入2% Tween-80 作为乳化剂。

1.3 培养基

马铃薯蔗糖培养基(PSA)：见文献[30]。

1.4 F.verticillioides 对氟啶胺的敏感性

采用菌丝生长速率法进行测定[32-34]。 用灭菌水(含0.2% Tween-80)稀释氟啶胺母液，在PSA 冷却到50 ℃左右时加入不同浓度的氟啶胺溶液，制成最终含氟啶胺0(CK)、0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、5.0 μg∕mL 的系列含药平板。F. verticillioides预培养5 d，制取直径5 mm的菌碟接种于含药平板上(菌丝面向下)，每皿1 个菌碟，每处理3 次重复。 25 ℃黑暗条件下培养5 d，十字交叉法量取菌落直径(mm)，取平均值。

抑制率=[(CK 的菌落直径-处理的菌落直径)∕(CK 的菌落直径-5)] ×100%。

通过浓度对数值(X)和抑制率几率值(Y)之间的线性回归关系求出毒力回归方程和EC50值。

1.5 不同作用机制杀菌剂对F.verticillioides 的活性

按1.4 方法分别配制含戊唑醇(0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、10 μg∕mL)、咪鲜胺(0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、5 μg∕mL)、氰烯菌酯(0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、5 μg∕mL)、多 菌 灵(0.031 25 μg∕mL、0.062 5 μg∕mL、0.125 μg∕mL、0.25 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1 μg∕mL)、氟 菌 唑(0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、5 μg∕mL)和二硫氰基甲烷(0.125 μg∕mL、0.25 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1 μg∕mL、2 μg∕mL、4 μg∕mL)系列浓度的PSA 平皿。 选用Fa6(氟啶胺的EC50值0.054 4 μg∕mL)和CSH11-28(氟啶胺的EC50值0.601 0 μg∕mL)两个菌株作为供试菌株，比较不同作用机制杀菌剂对F.verticillioides的毒力。

1.6 氟啶胺与不同作用机制杀菌剂的交互抗性

采用菌丝生长速率法[32]，选择10 个F.verticillioides菌株(Fa6、KCa7、FFca4、ZJG20、U2-2、U-3-1、ZJG2-3、JG2-5、CSH11-28、JH6)作供试菌株，测定戊唑醇、咪鲜胺、氰烯菌酯、多菌灵、氟菌唑和二硫氰基甲烷抑制F.verticillioides菌丝生长的EC50值。 将这些菌株对氟啶胺的EC50值(敏感性)与对其他杀菌剂EC50值进行相关性分析。

1.7 数据分析

用DPS7.05 软件进行数据整理，用Excel 2003 软件进行相关性分析和制图。

2 结果与分析

2.1 F.verticillioides 对氟啶胺的敏感性

供试的105 个F.verticillioides菌株，对氟啶胺的敏感性差异较大，EC50值最低为0.053 8 μg∕mL，最高为0.627 8 μg∕mL，两者相差11.67 倍。 氟啶胺对105 个F. verticillioides菌株的EC50值呈正态分布，经Shapiro-Wilks 检验，P=0.159 7(图1)。 氟啶胺抑制F.verticillioides菌丝生长的EC50值平均为(0.267 4 ±0.151 6)μg∕mL。

2.2 不同地区F.verticillioides 对氟啶胺敏感性差异

各市(县)菌株对氟啶胺的敏感性见表1。 来源于不同地区的F.verticillioides菌株对氟啶胺的敏感性差异不明显；来源于句容市的F. verticillioides菌株对氟啶胺的敏感性最低，平均EC50值为(0.334 7 ±0.144 8)μg∕mL；来源于泰兴的F. verticillioides菌株对氟啶胺的敏感性最高，平均EC50值为(0.175 9 ±0.040 0)μg∕mL。

表1 不同地区F.verticillioides 菌株对氟啶胺的敏感性Table 1 Sensitivity of isolate of F.verticillioides from difference regions to fluazinam

2.3 不同作用机制的杀菌剂对F.verticillioides 的敏感性

7 种杀菌剂对Fa6 菌株菌丝生长抑制活性由低到高依次为二硫氰基甲烷、氟菌唑、多菌灵、氰烯菌酯、戊唑醇、氟啶胺、咪鲜胺；对CSH11-28 菌株菌丝生长抑制活性由低到高依次为氟菌唑、二硫氰基甲烷、氟啶胺、多菌灵、戊唑醇、氰烯菌酯、咪鲜胺(表2)。 表明，氟啶胺对F.verticillioides的抑菌效果优于多菌灵、二硫氰基甲烷和氟菌唑，低于酰胺类杀菌剂咪鲜胺。

表2 F.verticillioides 对不同杀菌剂的敏感性Table 2 Sensitivity of F.verticillioides to diverse fungicides

2.4 氟啶胺与不同作用机制杀菌剂的交互抗性

U-3-1 抗氰烯菌酯EC50值为7.284 0 μg∕mL，JG2-5 抗多菌灵EC50值为5.001 0 μg∕mL，其他菌株对供试药剂均表现为野生敏感型。 通过EC50值线性回归分析，发现氟啶胺与二硫氰基甲烷、氟菌唑、多菌灵、氰烯菌酯、戊唑醇和咪鲜胺的决定系数分别是0.483 6(p=0.037 5)、0.342 7(p=0.038 4)、0.094 9(p=0.044 9)、0.108 8(p=0.357 4)、0.271 4(p=0.116 9)和0.367 4(p=0.042 8)。 表明，氟啶胺抑制F.verticillioides菌丝生长的EC50值与供试的其他6 种杀菌剂抑制F.verticillioides菌丝生长的EC50值之间相关性不显著，说明氟啶胺与这6 种杀菌剂之间不存在交互抗性(图2)。

3 结论与讨论

研究表明，氟啶胺对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)抑菌EC50值在0.001 6—0.053 1 μg∕mL[35]，对马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)抑菌EC50值在0.203 3—0.783 7 μg∕mL[36]，对水稻恶苗病菌抑菌EC50值为0.334 2 μg∕mL[28]。 本研究中，菌株采集地区还未使用氟啶胺进行水稻恶苗病防治，这些菌株是氟啶胺野生敏感菌株；氟啶胺对105 个F. verticillioides菌株的EC50值呈连续的线性分布(图1)，均值为(0.267 4 ±0.151 6)μg∕mL，可作为F.verticillioides对氟啶胺的敏感基线。

氟啶胺对番茄灰霉病菌不同菌株抑制菌丝生长的EC50值相差33.19 倍[35]；马铃薯晚疫病菌不同菌株对氟啶胺的敏感性差异不大[36]。 本研究中，氟啶胺对F.verticillioides不同菌株的EC50值差异可达11.67倍；这与纪建军[35]的研究结果相近，句容市菌株的EC50值最高，平均为0.334 7 μg∕mL；泰兴市菌株的EC50值最小，平均为0.175 9 μg∕mL；地区间菌株的平均EC50值无显著差异(表1)，表明不同菌株对氟啶胺的敏感性差异来源于菌株本身。

比较氟啶胺、戊唑醇、咪鲜胺、氰烯菌酯、氟菌唑、二硫氰基甲烷和多菌灵对F. verticillioides的抑菌活性，发现氟啶胺对F.verticillioides的抑菌效果优于多菌灵、二硫氰基甲烷和氟菌唑，抑菌效果明显低于咪鲜胺(表2)。 目前，F.verticillioides对多菌灵、咪鲜胺产生了明显的抗药性[20-24]，氟啶胺可以作为替代药剂之一用于水稻恶苗病的防治。 笔者用80—120 μg∕mL 的50%氟啶胺SC 药液浸渍水稻种子48 h，对水稻恶苗病的防治率在93.7%—100%(个人资料，待发表)。

将F.verticillioides对氟啶胺及戊唑醇、咪鲜胺、氰烯菌酯、氟菌唑、二硫氰基甲烷、多菌灵的敏感性的EC50值进行相关性分析，发现氟啶胺与其他供试的6 种杀菌剂对F.verticillioides敏感性没有显著相关性，说明F.verticillioides对氟啶胺与上述杀菌剂之间不存在交互抗性。 推测在目前F.verticillioides对多菌灵、咪鲜胺产生了明显的抗药性情况下，氟啶胺在生产上更有应用价值。

本研究测定了F.verticillioides对氟啶胺的敏感基线，比较了目前生产上应用于水稻恶苗病防治的6种杀菌剂对F.verticillioides活性的差异。 室内药剂驯化发现，番茄灰霉病菌对氟啶胺不易产生抗药性突变[35]；而F.verticillioides对氟啶胺抗药性风险如何，还未见报道。 下一步将在田间条件下比较氟啶胺和其他杀菌剂对水稻恶苗病的防治效果以及氟啶胺应用后F.verticillioides对氟啶胺的敏感性变化。