西瓜种质资源的枯萎病抗性鉴定

李超汉，朱丽华，杨红娟，宋荣浩，尤佳琪，顾卫红∗，倪秀红，陈建才

(1 上海市农业科学院设施园艺研究所∕上海市设施园艺技术重点实验室，上海201403；2 上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海201403；3 上海市浦东区农业技术推广中心，上海201201)

李超汉，朱丽华，杨红娟，等.西瓜种质资源的枯萎病抗性鉴定[J].上海农业学报，2020，36(4)：37-42

西瓜枯萎病是一种世界范围内的土传病害，病原菌为半知菌亚门尖孢镰刀菌西瓜专化型病原菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)[1]。 尖孢镰刀菌西瓜专化型存在生理小种0、1、2、3[2-3]共4 个小种，其中生理小种1 存在范围最广、致病力最强，也是我国最流行的生理小种[4]。 西瓜枯萎病菌是一种较顽固的土壤习居真菌，病原物在土壤里可以多年生存积累，还能随流水传播。 近20 年来，由于我国西瓜的集约化设施栽培面积迅速扩大，轮作栽培变得极为困难，导致西瓜枯萎病逐年加重，严重限制了我国西瓜产业的健康发展。 目前，国际上尚无有效药剂防治西瓜枯萎病，且大规模施用化学药剂对土壤生态环境破坏严重，不利于农业可持续发展。 嫁接栽培虽可减轻西瓜枯萎病的发生，但嫁接既增加生产成本，也使西瓜品质受到明显影响[5-7]。 因此，在鉴定抗西瓜枯萎病种质资源的基础上，进行抗病新品种选育与推广可以成为减轻枯萎病危害、保障西瓜生产安全的途径之一。

自19 世纪末Orton[8]开创了西瓜抗枯萎病育种的研究以来，美国在西瓜枯萎病病原菌的分化、抗病性鉴定方法、抗病遗传规律和抗病育种等方面取得了突出成就，并育成了许多抗病性强兼具优良农艺性状的西瓜品种，包括‘Charleston Gray’‘Jubilee’‘Crimson Sweet’‘Calhoun Gray’‘Smokylee’‘Summit’‘Dixilee’‘Sugarlee’等。 这些品种在美国和其他许多国家得到广泛应用，并成为各国抗枯萎病育种的优良种质[9-10]。 我国育种家们也以这些抗病品种为基础，相继育成了一批综合农艺性状较为优良的抗枯萎病西瓜新品种，如‘郑抗1 号’‘京抗2 号’‘京抗3 号’‘西农八号’‘抗病苏蜜’等[11-13]，为稳定我国西瓜生产做出了重要贡献。 但由于这些抗病西瓜品种的整体品质相对较差，且成熟期偏晚，不耐低温弱光，不适合设施栽培，而市场迫切需要适合设施栽培、优质、抗病、耐低温弱光的西瓜新品种。

本试验利用人工浸根接种，鉴定上海市农业科学院设施园艺研究所近年来创制的20 份优质、抗逆(耐低温弱光)西瓜种质资源的苗期枯萎病抗性情况，以期从中筛选出遗传稳定的抗病优质西瓜种质资源，为抗病抗逆优质西瓜新品种的选育提供直接亲本。

1 材料与方法

1.1 供试西瓜种质资源

供试西瓜种质资源及主要农艺性状见表1。 抗病品种‘Sugarlee’(CK1)和感病品种‘Sugarbaby’(CK2)为国际公认的抗枯萎病鉴定的对照品种，其余20 份供试种质资源的种子均由上海市农业科学院设施园艺研究所西瓜育种课题组自交纯化繁育。

表1 供试西瓜种质资源Table 1 The tested watermelon germplasm resources

1.2 苗期枯萎病抗性接种鉴定方法

1.2.1 西瓜枯萎病病原菌高致病株系的筛选

以国际公认的鉴别西瓜抗枯萎病的抗病对照品种‘Sugarlee’(CK1)和感病对照品种‘Sugarbaby’(CK2)为试材，对来源于中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组、江苏省农业科学院西甜瓜研究室以及本课题组分离保存的6 个西瓜枯萎病生理小种1 病原菌株系：FON-ZG、FON-48、FON-49、FON-56 和FON68 和FON-ST 进行了致病性测定。

将6 个不同来源的西瓜枯萎病病原菌分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基，置于28 ℃恒温箱内培养7 d，观测其生长活力、菌落和菌丝的特征。 然后用接种针挑取约2 mm ×2 mm 的菌丝块转移到马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于摇床，26 ℃、125 r∕min 培养10 d。 菌液用4 层灭菌纱布过滤，4 000 r∕min 离心20 min，弃上清，在显微镜下利用血球计数板将孢子用无菌水稀释至1 ×106个∕mL。

西瓜种子用1.5% NaClO 溶液消毒20 min，用自来水冲洗直至水不带颜色为止。 浸种8 h 后，将种子表面水分甩干，用湿纱布包裹，在28—30 ℃恒温箱内催芽24—30 h，约90%以上的种子胚根露出时，播种到50 孔穴盘里，育苗基质(草炭∶蛭石=3 ∶1)事先用120 ℃烘箱灭菌12 h。 大棚昼夜温度维持在20—28 ℃∕18—25 ℃，幼苗一叶一心时进行浸根接种。 分别以FON-ZG、FON-48、FON-49、FON-56、FON-68和FON-ST 为病原菌，将根部浸润在孢子浓度为1 ×106个∕mL 的悬浮液中10 min，以清水处理为对照，每个处理接种30 株，3 次重复。 接种后的幼苗移栽到装有灭菌基质的营养钵里，将营养钵置于塑料大棚，棚内温度在23—28 ℃，并用遮阳网遮光，2 d 后揭开遮阳网，剔除不正常的幼苗。 以接种20 d 后幼苗的枯萎率作为感病指标，评价不同菌株的致病力。

1.2.2 苗期接种最适孢子液浓度的筛选

根据菌株的致病力，以高致病株FON-56 为病原，以‘Sugarlee’和‘Sugarbaby’为试材，设置接种孢子液浓度分别为1 ×105个∕mL、5 ×105个∕mL、1 ×106个∕mL、5 ×106个∕mL，幼苗一叶一心时浸根接种，以清水处理为对照，每处理接种30 株，3 次重复，以接种20 d 后幼苗的枯萎率作为感病指标，筛选适宜接种的孢子液浓度。

1.3 苗期枯萎病抗性人工接种鉴定及抗性分级评价标准

以FON-56 为致病菌，孢子液浓度为1 ×106个∕mL，以‘Sugarlee’和‘Sugarbaby’为对照，采用浸根接种鉴定20 份西瓜种质资源的苗期抗病性，每个处理接种30 株，3 次重复，以接种20 d 后的枯萎率为评价标准。

以幼苗萎蔫枯死作为感病指标，从植株出现萎蔫症状时开始统计，每隔2 d 统计一次，直到接种后20 d止。 以Smarty 等[14]提出的标准进行抗性分级，以幼苗枯萎率作为分级评价标准。 高抗(HR)：枯萎率≤20%；中抗(MR)：20% ＜枯萎率≤50%；轻抗(LR)：50% ＜枯萎率≤80%；感病(S)：枯萎率＞80%。

1.4 大棚病圃重茬栽培枯萎病抗性鉴定

于2018 年和2019 年，连续两年在上海市农业科学院华漕试验站，采用连续15 年以上重茬栽培西瓜的大棚病圃栽培方式，对20 份西瓜种质资源进行重茬栽培枯萎病抗性鉴定。 试验设3 个小区，每个小区每品种定植20 株，采用育苗移栽方式，即电热温床育苗后，再移栽于大棚病圃，田间管理按常规生产，于植株伸蔓至开花坐果期调查各种质的植株枯萎率，并进行抗性评价，评价标准参照室内鉴定标准。

2 结果与分析

2.1 不同来源西瓜枯萎病菌的菌落形态特征

6 个菌株在PDA 培养基上培养7 d 后，其菌落形态特征见表2。 从外观上看，6 个菌落的形态没有明显差异，菌落直径为4.3—5.2 cm，菌落颜色分为白色、浅紫色或紫色，气生菌丝均呈白色绒毛状。 在40倍显微镜下观察，小孢子形状为椭圆形或卵形，大孢子为镰刀形或长棍形。 部分菌株的菌落形态和分生孢子形状见图1。

表2 不同来源西瓜枯萎病菌形态特征比较Table 2 Comparison of morphological characteristics of Fusarium oxysporum f.sp.niveum from different sources

2.2 不同来源西瓜枯萎病菌的致病性表现

由表3 可见，用6 个枯萎病菌株分别接种‘Sugarlee’后，‘Sugarlee’的幼苗枯萎率为0—5.27%，表现“高抗”。 其中，FON-49 致病性最弱，‘Sugarlee’对其表现“免疫”；FON-56 的致病性最强，‘Sugarlee’的枯萎率达5.27%；其余4 个菌株的致病性稍弱于FON-56。 以6 个枯萎病菌株分别接种‘Sugarbaby’后，‘Sugarbaby’的幼苗枯萎率均达90% 以上；对照处理的‘Sugarbaby’也出现少量幼苗枯萎(枯萎率2.78%)，这可能是生长过程中由于根系受损较严重引起的。 其中，FON-ZG 和FON-ST 的致病性最强，‘Sugarbaby’的枯萎率高达98% 以上；FON-56 的致病性次之，‘Sugarbaby’的枯萎率为97.16%；而FON-68、FON-49 和FON-48 的致病性较弱。 综合6 个菌株在‘Sugarlee’和‘Sugarbaby’上的致病表现，以FON-56 的致病性最强，FON-ZG 和FON-ST 次之，FON-48 和FON-68 稍弱，FON-49 的致病性最弱。

表3 不同来源西瓜枯萎病菌株在西瓜鉴别寄主上的致病性表现Table 3 Pathogenicity of Fusarium oxysporum isolates from different sources on watermelon hosts

2.3 不同接种孢子液浓度的致病性表现

由表4 可以看出，抗病对照品种‘Sugarlee’在FON-56 孢子液浓度低于1 ×106个∕mL 时枯萎率均小于3.20%，表现“高抗”；孢子浓度升高至5 ×106个∕mL 时，其枯萎率高达20.63%，表现“中抗”。 更为明显的是，感病品种‘Sugarbaby’的枯萎率随着FON-56 孢子液浓度的增加呈现急剧上升的趋势：孢子浓度为1 ×105个∕mL 时，枯萎率为78.02%；当孢子浓度为5 ×105个∕mL 时，枯萎率达84.25%，表现“感病”；孢子浓度增加到1 ×106个∕mL 和5 ×106个∕mL 时，枯萎率均高达90%以上。 综合评价不同浓度的FON-56孢子在抗病品种‘Sugarlee’和感病品种‘Sugarbaby’上的致病性表现，以接种孢子液浓度5 × 105—1 ×106个∕mL为宜。 若接种孢子液浓度过低，会使感病品种的致病潜育期延长，而接种孢子浓度过高，由于根系的损伤，则可能导致抗病品种表现“感病”，从而影响抗病性鉴定的准确性。

表4 不同接种孢子浓度对西瓜鉴别寄主的致病性Table 4 Pathogenicity of different inoculation concentrations on watermelon hosts

2.4 不同西瓜种质资源的苗期抗枯萎病表现

由表5 可以看出，供试的20 份西瓜种质资源在接种高致病菌株FON-56 后，其抗性表现差异明显。对FON-56 菌株表现“高抗”的种质有Su-ck-1、W98-1-4 和W958-3-6，占参试种质总数的15.0%；对FON-56 菌株表现“中抗”的种质包括V16-3、V13-1、V13-9、V13-11 和W23-18，占参试种质总数的25.0%；仅BY-2 对FON-56 表现“轻抗”，占参试种质总数的5.0%；其余11 份种质均对FON-56 表现“感病”，占参试种质总数的55.0%。 供试材料中没有对FON-56 表现免疫的种质。

表5 不同西瓜种质资源的苗期抗枯萎病性鉴定结果Table 5 Identification of resistance to Fusarium oxysporum of different watermelon germplasms at seedling stage

2.5 不同西瓜种质资源的大棚病圃抗病性表现

由表6 可见，供试西瓜材料中没有表现“免疫”的种质，表现“高抗”的种质有7 个，分别是Su-ck-1、W98-1-4、W958-3-6、V16-3、V13-1、V13-9 和V13-11；表现“中抗”的种质为BY-2 和W23-18，其余11 份种质均表现为“感病”。 不同西瓜种质在大棚病圃栽培条件下成株期的抗病性差异较大，总体表现与苗期鉴定结果一致。 在大棚病圃栽培条件下，大部分西瓜种质的植株枯萎率比苗期人工接种鉴定结果明显降低，这可能是由于病圃土壤中西瓜枯萎病原菌的孢子存活数较低或致病性没有FON-56 强所致。

表6 大棚病圃栽培条件下不同西瓜种质资源的抗病性表现Table 6 Resistance to Fusarium wilt of different watermelon germplasms planted in greenhouse disease nursery

3 讨论与结论

西瓜种质资源枯萎病抗性的苗期人工接种鉴定技术是开展西瓜抗病育种研究最常采用的技术之一，能够使育种工作者快速了解种质资源的抗病性表现。 前人研究认为，西瓜枯萎病的发生与病原菌的专化型、病原菌的致病性、品种的抗性及发病环境条件等密切相关[15-19]。 其中，孢子液浓度是影响人工接种鉴定西瓜种质资源苗期枯萎病抗性准确性的重要因素之一。 众多研究表明，接种孢子浓度过低，会延长发病潜育期和鉴定周期，甚至可能使原本感病的种质的病情指数降低，从而使其表现“轻抗”；若接种孢子浓度过高，则可能使原本表现抗病的种质发病率升高，致其表现“中抗”或“轻抗”[15，17-19]。 本研究表明，来源于江苏省农业科学院西甜瓜研究室的西瓜枯萎病菌株FON-56 的致病性最强，其接种孢子液浓度以5 ×105—1 ×106个∕mL 为宜，能够使供试种质资源的幼苗在较短时间内发病，不同重复之间的病情指数稳定，抗病性鉴定结果准确，这与前人研究结果一致[15-17，19-20]。

抗病资源的获得是开展西瓜抗病育种的关键，本试验鉴定了20 份不同西瓜种质资源的苗期和成株期抗枯萎病性，从中筛选出3 份苗期和成株期均表现高抗的种质，分别是Su-ck-1、W958-3-6 和W98-1-4；苗期和成株期均表现中抗种质5 份，分别是V16-3、V13-1、V13-9、V13-11 和W23-18；轻抗种质1 份，以及感病种质11 份。 其中，Su-ck-1、W958-3-6、W98-1-4、V16-3、V13-1、V13-9 和V13-11 等高抗和中抗种质均表现为中大果型、优质、高产、耐低温耐弱光性强，适合作为优质抗病西瓜新品种选育的直接亲本及中间材料。

长期以来，我国西瓜品种资源的遗传基础狭窄，缺乏有效的抗源，导致我国西瓜的抗病育种研究难以取得突破性进展。 由于我国西瓜抗病育种大多是直接利用来自美国的一些抗病品种如‘Sugarlee’‘Charleston Gray’‘Calhoun Gray’等，除少数品种外，只有较少品种是采取多亲杂交等手段来融合不同的抗病西瓜种质[9-13]，从而导致我国育成的西瓜抗病品种之间存在较多的类似性状。 由于西瓜的抗病性与品质具有负相关性，在栽培品种的选育过程中，随着品质的不断提升，其抗病性却逐渐下降甚至消失，从而导致一些品质优秀的品种抗病性较差，而一些抗病品种的品质则较差[21]。 在当今市场，消费者最关注西瓜的口感品质，而生产者更看重产量。 要解决西瓜产量和品质之间的矛盾，除了完善西瓜的栽培技术外，另一个重要手段就是选育高抗病兼具高品质的品种。 本研究筛选出的高抗枯萎病的西瓜种质Su-ck-1、W958-3-6 和W98-1-4 等都是近几年项目组新创制的优质抗病新种质，综合农艺性状优良，尤其品质性状显著优于引进品种，在抗病优质西瓜新品种的选育研究上将具有极大的应用价值。