GFAP联合cfDNA测定在复杂性热性惊厥脑损伤中的临床研究

凌寅杰朱焰 施明杰 路攀 袁琛

[摘要] 目的 研究復杂性热性惊厥患儿静脉血GFAP浓度、静脉血和脑脊液的cfDNA含量，并评价两者的相关性。方法 选择2019年1～12月在湖州市第一人民医院住院治疗的78例CFS患儿作为研究组，选择同期因发热疑似伴颅内感染，最终经脑脊液检查、脑电图、头颅MRI和病情观察排除颅内感染的住院患儿27例为对照组。分别测定两组患儿入院第1天和第5天的静脉血GFAP浓度，测定两组患儿入院当天的静脉血和脑脊液cfDNA含量。结果 研究组患儿静脉血GFAP水平（第1天和第5天）均较对照组水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。研究组患儿与对照组患儿之间的脑脊液cfDNA完整度具有显著性差异，且研究组患儿的脑脊液cfDNA含量较对照组显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。患儿静脉血GFAP水平与脑脊液cfDNA水平呈正相关关系。 结论 通过GFAP联合cfDNA含量测定，证实CFS患儿在分子和细胞层面存在惊厥后脑损伤。惊厥导致脑损伤的持续性，而非短暂消失，并可导致神经细胞死亡，引起脑脊液cfDNA浓度明显增加。

[关键词] GFAP;cfDNA;复杂性热性惊厥;脑脊液;相关关系

[中图分类号] R720.597          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）17-0029-04

Clinical study of GFAP combined with cfDNA determination in brain damage caused by complex febrile seizures

LING Yinjie   ZHU Yan   SHI Mingjie   LU Pan   YUAN Chen

Department of Pediatrics， Huzhou First Peoples Hospital in Zhejiang Province， Huzhou   313000， China

[Abstract] Objective To study the GFAP concentration of venous blood， cfDNA content in venous blood and cerebrospinal fluid in children patients with complex febrile seizures， and to evaluate the correlation between the two. Methods From January 2019 to December 2019， 78 children patients with CFS who were hospitalized for treatment in Huzhou First People's Hospital were selected as the study group. 27 hospitalized children patients suspected to be complicated with intracranial infection due to fever during the same period， who were excluded from intracranial infection through cerebrospinal fluid examination， electroencephalogram， skull MRI， and disease observation， were selected as the control group. The venous blood GFAP concentration in the two groups of children patients was determined on Day 1 and Day 5 of admission. The venous blood and cerebrospinal fluid（cfDNA） contents of the two groups of children patients were determined on the day of admission. Results The venous blood GFAP levels in the study group（Day 1 and Day 5） were higher than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There were significant differences in cerebrospinal fluid cfDNA integrity in children patients between the study group and the control group. The content of cfDNA in cerebrospinal fluid in the study group was increased significantly compared with that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was a positive correlation between venous blood GFAP levels and cerebrospinal fluid cfDNA levels in children patients. Conclusion GFAP combined with cfDNA determination confirms that children patients with CFS have brain damage after seizures at the molecular and cellular levels. Seizures cause persistent， not temporary disappearance of brain damage， and can lead to the death of nerve cells， causing a significant increase in cerebrospinal fluid cfDNA concentration.

[Key words] GFAP; cfDNA; Complex febrile seizures; Cerebrospinal fluid; Correlation

复杂性热性惊厥（complex febrile seizures，CFS），是儿童期常见的神经系统疾病。目前CFS的具体发病机制不清，如离子通道机制、脑脊液的酸碱平衡异常、神经递质失调等[1]。单纯性热性惊厥的患儿演变为癫痫的概率约2%～5%，而CFS则是其3.6倍[2]。除了增加罹患癫痫的风险外，CFS还可以造成不同程度的脑损伤。神经胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidicprotein，GFAP）可作为惊厥后脑损伤的标志物[3]，但不能评价是否存在神经细胞坏死。循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）是存在于人体中，在细胞外处于游离状态的DNA分子，其在人体血液和组织液等中均可检出。cfDNA的相关检测在产前诊断中已经取得了很多研究进展，另外通过对外伤、中风、颅内肿瘤和自身免疫性疾病患者的研究发现，其体内的cfDNA水平大大高于健康人[4-6]。而对于cfDNA在CFS患者中的研究报道较少。

本研究通过对78例CFS患儿和27例疑似颅内感染患儿的静脉血和脑脊液cfDNA含量，以及不同时期静脉血GFAP浓度进行测定，首次探讨cfDNA含量与CFS脑损伤的关系，同时对于两组患儿静脉血及脑脊液cfDNA含量与静脉GFAP浓度的相关性进行统计分析，为临床上的诊断及预后提供参考。

1资料与方法

1.1临床资料

选择2019年1～12月在湖州市第一人民医院住院诊断为复杂性热性惊厥的患儿共78例设为研究组，同期因发热疑似伴颅内感染，最终经脑脊液检查、脑电图、头颅MRI和病情观察排除颅内感染的住院患儿27例为对照组。研究组男48例，女30例，平均年龄（17.2±1.5）个月，平均发热时间（4.2±0.4）d;对照组男16例，女11例，平均年龄（18.1±1.5）个月，平均发热时间（3.9±0.5）d，两组患儿的性别、年龄、平均发热时间无显著性差异（P>0.05），可进行统计学分析。所有参与本研究的患儿家属均签署知情同意书，本研究经湖州市第一人民医院伦理委员会批准。

1.2纳入标准

根据国内《热性惊厥诊断治疗与管理专家共识》（2016）[7]，CFS无严格限定年龄，在惊厥发作时，发热超过38℃或者至少在发作后出现发热，同时符合以下四项的一项及以上：①一次惊厥持续时间大于>15 min。②24 h内反复发作2次及以上。③局灶性发作。④发作后可有异常的神经系统表现或既往有神经系统缺陷。

1.3排除标准

①中枢神经系统急性或慢性疾病，如感染、外伤、出血、占位等。②患有严重的其他系统基础疾病（如紫绀性心脏病、肝肾功能不全等）。③严重的遗传代谢性疾病[8]。

1.4 方法

1.4.1 静脉血GFAP浓度测定  所有研究组、对照组患儿于入院第1天和第5天，分别采集静脉血2 mL。待血液静置后，在离心机中以4000 r/min 的速度离心5 min，留取血清后用-20℃冰箱中冷冻、保存、待测。采用ELISA法進行血清GFAP检测，操作步骤严格按照试剂盒说明，检测试剂盒购于上海瑶韵生物科技公司。

1.4.2静脉血和脑脊液cfDNA浓度及完整性测定    两组患儿于入院当天抽取静脉血3 mL，通过腰椎穿刺术留取脑脊液3 mL，将所采标本置于EDTA管中，离心（2500 rpm，5 min）后取上清液，利用FirePureTM Circulating Free DNA Mini Kit试剂盒（苏州）提取cfDNA，每个标本最终洗脱体积为50 μL。提取的DNA经NanoDrop ND-1000核酸定量仪测定吸光度（A260/A280），取比值为1.6～1.8的样本并对各样本浓度进行测定。cfDNA完整性检测采用定量聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定血浆ALU115基因（115bp）和ALU247基因（247bp）浓度，以ALU115/ALU247表示cfDNA的完整性。RT-PCR方法见参考文献[9]。RT-PCR检测ALU长短片段含量：根据TaKaRa公司SYBR Green Real-time PCR试剂盒的流程进行操作。引物序列：ALU-115bp上游5-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3，下游5-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3;ALU247 bp上游5-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3，下游5-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3，以上2对PCR引物均由上海生工生物工程公司合成。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火31 s，72℃延伸 32 s，40个循环，反应液配制在冰上进行，每个样品重复3次。

1.5统计学处理

所有数据均采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，计量资料用均数±标准差表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。数据组间相关系数利用Correl方程[10]计算。

2 结果

2.1 两组患儿静脉血GFAP水平

研究组患儿静脉血GFAP水平（第1天和第5天）均较对照组水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。其中研究组患儿随着病程推移，静脉血GFAP水平逐渐升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 两组患儿cfDNA完整度比较

两组cfDNA完整度检测发现，研究组患儿与对照组患儿之间的静脉血cfDNA完整度无显著性差异（P>0.05）;研究组患儿与对照组患儿之间的脑脊液cfDNA完整度具有显著性差异（P<0.05）。见表2。

2.3 两组患儿cfDNA含量比较

通过荧光定量分析方法发现，相对于对照组，研究组患儿的脑脊液cfDNA含量显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），而两组的静脉血cfDNA含量无显著性差异（P>0.05）。见表3。

注：组间显著性差异，a表示P<0.05，b为P>0.05

2.4 研究组患儿静脉血GFAP浓度与其静脉血和脑脊液的cfDNA水平相关关系

利用Correl方程对研究组患儿静脉血GFAP浓度与其静脉血和脑脊液的cfDNA水平进行相关性分析，结果显示患儿静脉血GFAP水平与静脉血cfDNA水平的Correl系数为0.1805，无相关关系（P>0.05）。而患儿静脉血GFAP水平与脑脊液cfDNA水平的Correl系数为0.9716，呈现正相关关系，差异有统计学意义（P<0.01）。

3讨论

单纯性热性惊厥（Simple febrile seizures，SFS）指小儿伴有发热的惊厥发作，并排除颅内感染和癫痫等疾病，预后良好。但复杂性热性惊厥的特点为反复发作、长时间发作等，可对患儿产生惊厥后脑损伤，导致认知功能下降，甚至继发癫痫[11]。

CFS的急性期治疗，主要为控制惊厥和感染。现在有多种血清标志物提示惊厥后脑损伤，如神经元特异性烯醇化酶、脑源性神经营养因子、热休克蛋白70、GFAP等[12-13]。本研究发现研究组患儿静脉血GFAP水平（第1天和第5天）均较对照组水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），再次证明GFAP是惊厥后脑损伤的可靠标志物。但研究组患儿静脉血GFAP水平在第5天高于第1天，说明了惊厥脑损伤的持续性，而非短暂消失。目前的血清标志物只能在实验室层面提示脑损伤存在，但缺乏立体的判断。有研究表明，在部分CFS患儿早期进行头颅MR检测，发现海马肿胀，而后逐渐演变为海马硬化和萎缩[14-16]。但该检查对影像诊断技术要求高，且缺乏统一的标准，容易造成误诊、漏诊。这就需要从其他方向探索CFS脑损伤的相关研究。

cfDNA是一种细胞外游离状态的DNA，可在人体血液和组织液中检测到。其优点在于：大部分游离DNA多长度小于200 bp，易于检测;可重复性好;不可透过血脑屏障[17]。对cfDNA的检测在疾病的监控、胎儿的产前诊断及肿瘤的研究中已经有了很多应用[18-19]，但是其含量测定与CFS脑损伤关系研究甚少。通过荧光定量法，研究组患儿的脑脊液cfDNA含量较对照组显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），而两组静脉血cfDNA含量无显著性差异（P>0.05），提示惊厥可明显增加脑脊液cfDNA浓度，而对静脉血的cfDNA含量无明显改变。由于细胞凋亡产生的ALU片段长度明显短于非细胞凋亡产生的[20]，所以通过两组cfDNA完整度检测，我们发现研究组患儿与对照组患儿之间的静脉血cfDNA完整度无显著性差异;研究组患儿与对照组患儿之间的脑脊液cfDNA完整度具有显著性差异。同时由于血脑屏障的作用，脑脊液中的cfDNA进入外周血，而外周血的cfDNA难以进入脑脊液。故可以推断CFS患儿脑脊液增加的cfDNA是通过细胞死亡产生的。由于无法对人类大脑进行病理学的检测，我们通过Correl方程分析，发现静脉血GFAP水平与脑脊液cfDNA水平的Correl系数为0.9716呈正相关，意味着从分子和细胞的水平证实了CFS产生脑细胞损伤的部分机制。

综上所述，对脑脊液cfDNA的测定，是明确CFS患儿存在脑损伤的依据。由于神经细胞的不可再生，故对CFS在临床治疗中需要强调预防和控制惊厥的发生和发展，同时对未来治疗CFS脑损伤提供作用靶点。由于本研究纳入的研究对象有限，需进一步增加样本量，同时拟进一步对SFS患儿的脑脊液cfDNA的测定，以期获得更加精准的研究数据。

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（收稿日期：2020-01-20）