活络效灵丹通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路降低青光眼兔视神经损伤的研究※

欧阳云 刘正立 徐春龙 吴加亮 彭 俊 彭清华

(江苏省盐城市中医院眼科，江苏 盐城 224000)

青光眼是眼科临床最常见的不可逆致盲性眼部疾病，以病理性高眼压导致的视神经损伤为主要特点，以视网膜神经节细胞凋亡及视野特征性缺损为共同特征。目前全球有超过7 000万人受青光眼疾病的困扰，其中约10%双眼致盲，占失明病例的12%[1]。随着年龄增长，青光眼发病率、致盲率显著增加[2]。目前，青光眼的发病机制尚未完全清楚，研究认为局部缺血、氧化应激及炎性反应引发的视网膜神经节细胞凋亡和视神经轴退化是青光眼的重要发病机制[3-4]。眼压升高是青光眼公认的危险因素，因此治疗的主要措施是采取降眼压药物，或实施滤过手术以降低眼压。但是，仅采取降低眼压的治疗措施并不能完全阻止视网膜神经节细胞凋亡和视神经的萎缩，进而导致很大一部分患者视力持续受损，甚至丧失视力。因此，有效的药物保护视神经是青光眼治疗的重要方向。

本实验通过单眼前房内灌注法建立兔青光眼模型，予活络效灵丹治疗，观察其降低眼压、保护视神经的作用，并通过比较治疗前后凋亡蛋白活性半胱天冬酶3(cleaved-caspase-3)、活性半胱天冬酶9(cleaved-caspase-9)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤因子2相关X蛋白(Bax)和B细胞淋巴瘤因子2相关XL蛋白(Bcl-xl)表达变化，以及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的状态，探讨活络效灵丹治疗青光眼的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年新西兰长耳兔36只，体质量2.5～3 kg，雌雄各半。购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物合格证号：SCXK(苏)2017-0001。饲养环境：温度20～25 ℃，湿度40%，自由饮食、饮水，每日光照12 h。

1.1.2 实验药物及试剂 活络效灵丹药物组成：当归15 g，丹参15 g，制乳香15 g，制没药15 g。上药用10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后文火煎10 min，用2层纱布过滤，将过滤液浓缩，最终含生药浓度0.15 g/mL，使用微孔孔径0.22 μm尼龙滤膜过滤，分别浓缩至0.2、0.6、1.8 g/mL生药浓度，分装于50 mL的一次性离心管中，于4 ℃避光保存备用。1%戊巴比妥钠溶液[默克化工技术(上海)有限公司]；注射用鼠神经生长因子[舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，国药准字S20060023]；3%复合卡波姆溶液(北京索莱宝科技有限公司)；原位末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒[内含蛋白酶K工作液、TUNEL反应混合液、末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT酶)、二氨基联苯胺(DAB)溶液等](美国Biovision公司)；苏木素—伊红(HE)染色试剂盒(内含苏木素染液、分化液、伊红染液)[北京索莱宝科技有限公司]；蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；cleaved-caspase-3抗体、cleaved-caspase-9抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Bcl-xl抗体、PI3K抗体、Akt抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶标记抗体(英国Abcam公司)；化学发光液(美国Biosciences公司)；盐酸莫西沙星滴眼液(美国Alcon Laboratories公司，进口药品注册证号H20180089)；硫酸庆大霉素溶液(北京索莱宝科技有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；中性福尔马林固定液(北京索莱宝科技有限公司)；二甲苯溶液[生工生物工程(上海)股份有限公司]；4×蛋白上样缓冲液、含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)(北京索莱宝科技有限公司)。

1.1.3 实验仪器 眼科手术显微镜、眼科弯镊、眼科弯剪(苏州六六视觉科技股份有限公司)；病理切片机(德国Leica公司)；笔式眼压计(美国Mentor公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将36只兔按照随机数字表法分为6组，即空白组、模型组、对照组及活络效灵丹低、中、高剂量组，各6只。

1.2.2 模型制备 实验前将兔在正常条件下饲养1周，以熟悉环境。造模方法：兔耳缘静脉注射1%戊巴比妥钠溶液3 mL/kg麻醉，对兔右眼进行手术制备青光眼模型。除空白组外，其余各组行前房穿刺，抽出房水0.1 mL，缓慢灌注3%复合卡波姆溶液0.1 mL，空白组注射等容积的0.9%氯化钠注射液，术后统一予盐酸莫西沙星滴眼液1滴滴术眼，每日3次，连续用药4 d。术后检测眼压，发现兔眼压持续升高，>24 mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa)，证明模型制备成功。

1.2.3 给药方法 造模成功后持续用药4周。空白组、模型组予0.9%氯化钠注射液5 mL/(kg·d)灌胃，每日1次；对照组予注射用鼠神经生长因子1.635 μg/kg肌肉注射，每日1次；活络效灵丹低、中、高剂量组分别予活络效灵丹1.0、3.0、9.0 g/(kg·d)灌胃，根据临床成人用药剂量的1、3、9倍计算，药物用蒸馏水溶解。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 眼压测量 分别于给药1、2、4周测量兔右眼眼压(1 mmHg≈0.133 kPa)。应用笔式眼压计进行眼压测量，均在固定时间10:00进行，每只兔重复6次，取平均值并记录，测量完成后用盐酸莫西沙星滴眼液滴眼。

1.3.2 视网膜获取及切片制备 给药结束后通过空气栓塞法处死兔，摘取眼球，使用冰PBS冲洗后，置于中性福尔马林固定液中固定30 min。将固定好的眼球取出，吸干表面残留的中性福尔马林固定液后，沿角膜缘剪开，将角膜、晶状体、玻璃体去除后，剥离视网膜并继续置于中性福尔马林固定液中固定2 h。使用梯度乙醇(分别为85%、95%、无水乙醇)脱水，用二甲苯溶液透明组织，石蜡块包埋，切片完成后置于-20 ℃冷冻保存。

1.3.3 HE染色 将石蜡切片取出，置于二甲苯溶液，浸洗2次，每次5 min，脱蜡，依次浸泡于梯度乙醇(分别为100%、95%、85%、70%)，每个浓度浸泡3 min脱水。使用苏木素染液染色10 min后，PBS洗去多余染料，置于分化液分色5 min，再使用伊红染色5 min，依次浸泡于梯度乙醇(分别为无水乙醇、95%、85%、70%)，每个浓度浸泡3 min，用二甲苯溶液透明组织，树脂胶封片后即可置于400倍光学显微镜下，观察染色情况。每组随机取2张切片，每个切片选5个视野，使用Image pro plus软件读取5个视野中视网膜神经节细胞数量，并取其均值。

1.3.4 TUNEL检测 将石蜡切片取出，置于二甲苯溶液，润洗2次，每次5 min，脱蜡，依次浸泡于梯度乙醇(分别为100%、95%、85%、70%),每个浓度浸泡3 min脱水。PBS润洗2次，用蛋白酶K工作液处理组织，37 ℃处理15 min后滴加TUNEL反应混合液，37 ℃暗室反应1 h。PBS润洗2次后放入3%过氧化氢(H2O2)溶液中，室温孵育15 min，TDT酶37 ℃连接1 h；辣根过氧化物酶标记抗体37 ℃标记30 min；润洗后滴加DAB溶液50 μL，苏木素染液染色25 s，再次使用梯度乙醇(分别为85%、95%、无水乙醇)脱水，用二甲苯溶液透明组织，树脂胶封片后即可置于400倍光学显微镜下，观察染色情况。切片底色为白色，视网膜神经节细胞凋亡阳性细胞核呈浅褐色。每组随机取2张切片，每个切片选5个视野，使用Image pro plus软件读取5个视野中的视网膜神经节细胞凋亡阳性细胞数，并取其均值，细胞凋亡率=凋亡阳性细胞数/视网膜神经节细胞总数×100%。

1.3.5 免疫印迹(Western Blot)检测 将视网膜充分剪碎后置于冰上匀浆，加入适量裂解液处理30 min，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，取其上清为蛋白溶液，然后用蛋白定量试剂盒对样品蛋白溶液进行定量。样品加入4×蛋白上样缓冲液后取20 μL加入上样槽，按照浓缩胶50 V、分离胶100 V电压进行电泳。电泳完成后进行转膜，按照滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸的顺序依次放置，恒流200 mA转膜2 h。转膜完成的硝酸纤维素膜放入3%脱脂乳中封闭后即可孵育一抗、二抗，一抗于4 ℃过夜孵育，二抗于室温孵育1 h。经PBST(PBS+TWeen-20)洗涤3～5次后使用化学发光法，在硝酸纤维素膜上滴加化学发光液，置于暗箱中曝光。用Imag J图像处理软件进行灰度分析，用目标蛋白与对应的内参(GAPDH)的比值，得出目标蛋白的表达量。

2 结 果

2.1 各组兔右眼给药1、2、4周眼压比较 见表1。

由表1可见，给药1、2、4周，模型组兔右眼眼压均高于空白组(P<0.05)。给药1周，对照组、活络效灵丹高剂量组兔右眼眼压高于模型组(P<0.05)；给药2、4周，对照组及活络效灵丹低、中、高剂量组兔右眼眼压均低于模型组(P<0.05)。给药1周，活络效灵丹低、中剂量组兔右眼眼压低于对照组(P<0.05)；给药2、4周，活络效灵丹低、中剂量组兔右眼眼压高于对照组(P<0.05)。给药1、2、4周，对照组与活络效灵丹高剂量组兔右眼眼压比较差异均无统计学意义(P>0.05)。给药1周，活络效灵丹低、中、高剂量组兔右眼眼压比较差异均无统计学意义(P>0.05)；给药2、4周，活络效灵丹低、中、高剂量组兔右眼眼压组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组兔右眼给药1、2、4周眼压比较

2.2 各组兔视网膜组织HE染色比较 空白组视网膜结构保留完整且排列整齐，层次分明，神经节细胞呈椭圆形；模型组视网膜结构发生断裂，厚度明显变薄，间质出现水肿，且神经节细胞数量减少，神经节细胞形态不规则；对照组与空白组视网膜结构形态相近；活络效灵丹低剂量组视网膜结构较模型组稍有改善；活络效灵丹中、高剂量组视网膜结构基本正常，层次较为分明，仅活络效灵丹中剂量组部分视网膜神经节细胞形态发生改变。见封3，图1。

2.3 各组兔视网膜神经节细胞数量比较 见表2。

表2 各组兔视网膜神经节细胞数量比较

个

由表2可见，模型组兔视网膜神经节细胞数量低于空白组(P<0.05)。对照组及活络效灵丹中、高剂量组兔视网膜神经节细胞数量高于模型组(P<0.05)。活络效灵丹低剂量组兔视网膜神经节细胞数量低于对照组(P<0.05)。对照组与活络效灵丹中、高剂量组兔视网膜神经节细胞数量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。活络效灵丹中、高剂量组兔视网膜神经节细胞数量均高于活络效灵丹低剂量组(P<0.05)；活络效灵丹中剂量组与活络效灵丹高剂量组兔视网膜神经节细胞数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组兔视网膜神经节细胞凋亡率比较 见表3。

表3 各组兔视网膜神经节细胞凋亡率比较

由表3可见，模型组兔视网膜神经节细胞凋亡率高于空白组(P<0.05)；对照组及活络效灵丹中、高剂量组兔视网膜神经节细胞凋亡率均低于模型组(P<0.05)；活络效灵丹低、中、高剂量组兔视网膜神经节细胞凋亡率均高于对照组(P<0.05)；活络效灵丹低、中、高剂量组兔视网膜神经节细胞凋亡率组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。各组兔视网膜神经节细胞凋亡表达见封3，图2。

2.5 各组兔视网膜神经节细胞凋亡蛋白表达水平比较 见表4。

表4 各组兔视网膜神经节细胞凋亡蛋白表达水平比较

由表4可见，模型组cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax表达水平均高于空白组(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-xl表达水平均低于空白组(P<0.05)；对照组及活络效灵丹低、中、高剂量组cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax表达水平均低于模型组(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-xl表达水平均高于模型组(P<0.05)；活络效灵丹低、中、高剂量组cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax表达水平均高于对照组(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-xl表达水平均低于对照组(P<0.05)；活络效灵丹高剂量组cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax表达水平均低于活络效灵丹低、中剂量组(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-xl表达水平均高于活络效灵丹低、中剂量组(P<0.05)。对照组cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bcl-2、Bcl-xl、Bax与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组兔视网膜神经节细胞凋亡蛋白表达条带图见图3。

注：①空白组；②模型组；③对照组；④活络效灵丹低剂量组；⑤活络效灵丹中剂量组；⑥活络效灵丹高剂量组

2.6 各组兔PI3K/Akt信号通路蛋白表达水平比较 见表5。

表5 各组兔PI3K/Akt信号通路蛋白表达水平比较

由表5可见，模型组PI3K、Akt蛋白表达水平均低于空白组(P<0.05)；对照组、活络效灵丹高剂量组PI3K蛋白表达水平均高于模型组(P<0.05)，对照组及活络效灵丹中、高剂量组Akt蛋白表达水平均高于模型组(P<0.05)。活络效灵丹低、中剂量组PI3K、Akt蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)。活络效灵丹高剂量组PI3K、Akt蛋白表达水平均高于活络效灵丹低、中剂量组(P<0.05)；活络效灵丹高剂量组PI3K、Akt蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组兔PI3K/Akt信号通路蛋白表达条带图见图4。

注：①空白组；②模型组；③对照组；④活络效灵丹低剂量组；⑤活络效灵丹中剂量组；⑥活络效灵丹高剂量组

3 讨 论

目前，青光眼的发病机制尚未完全清楚，但视网膜神经节细胞凋亡和视神经轴退化对青光眼的发生发展至关重要。临床治疗青光眼主要以降低并维持正常眼压为目的，包括激光、药物及手术等[5-6]。许多青光眼患者眼压虽已降至正常范围，但视野损害依然持续[7]，因此单纯降低眼压的治疗手段并不能真正有效地改善青光眼所造成的损伤，更重要的是阻止视网膜神经节细胞凋亡和视神经萎缩，最大程度地保护现有的视力、视野。

中医学对青光眼的认识最早可追溯至《神农本草经》中“青盲”这一病症。《秘传眼科龙木论》将青光眼归属于“五风内障”，并根据发病原因、临床特征、预后分为“绿风”“黑风”“青风”“乌风”及“黄风”5种内障。《医宗金鉴》提出五风内障治疗应以祛风散热、益精明目为主，《审视瑶函》提出“补肝滋肾，瞳仁乃固”。我们认为，青光眼由风、火、痰所致，脉络瘀滞，脉络阻塞致神水流出，积聚于眼内，又加重脉络瘀滞，互为因果，形成恶性循环。治宜理气活血，化瘀通络。活络效灵丹出自张锡纯《医学衷中参西录》，最初用于治疗各种瘀血阻滞之痛，现用于治疗各种气血瘀滞、经络受阻类疾病。方中当归、丹参补血活血；制乳香、制没药辛温通散，活血行气。现代药理研究表明，丹参提取物能改善微循环，改善视网膜神经元间的物质传递与运输，从而提高视网膜血管和神经的耐缺氧能力，改善青光眼缺血性视神经病变的缺血、缺氧状况[8-10]；当归提取物能有效降低大鼠眼压及视网膜组织丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平，清除活性氧自由基[11]；乳香能抑制白细胞介素1(IL-1)介导的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞迁移及核因子κB(NF-κB)核转移[12-13]。

本实验以复合卡波姆溶液前房注射造成的青光眼兔为研究对象，观察活络效灵丹对青光眼的治疗效果。神经生长因子是一种重要的神经生长调节因子，对神经细胞的生长、发育及再生有重要的调节作用，青光眼视神经中神经生长因子和神经生长因子受体蛋白表达下降，神经生长因子注射液能阻止或延缓视网膜神经节细胞损伤，改善青光眼症状及预后。此外，神经生长因子是具有营养神经元和促进轴突生长双重生物学功能的神经细胞生长调节因子，可有效减少急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的凋亡，因此本实验以神经生长因子注射液为阳性药物对照。

因为复合卡波姆溶液诱发的兔青光眼模型能长时间引起眼压中度、稳步升高[14]，本研究成功建立了兔青光眼模型。首先需检测活络效灵丹给药前后模型兔眼压变化。结果显示在模型建立成功4周后，模型组兔依然保持较高眼压，活络效灵丹组青光眼兔眼压下降，并表现出剂量依赖性，证明活络效灵丹具有降低复合卡波姆溶液造成的高眼压症状。

通过各组兔视网膜神经节细胞数量比较发现，对照组及活络效灵丹中、高剂量组均高于模型组(P<0.05)；各组兔视网膜神经节细胞凋亡率比较，对照组及活络效灵丹中、高剂量组凋亡率均低于模型组(P<0.05)，活络效灵丹中、高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)，神经节细胞凋亡率与剂量成反比。说明注射用鼠神经生长因子和活络效灵丹高剂量组均具有抑制视网膜神经节细胞凋亡的作用，且作用效果相似。

视网膜神经节细胞凋亡导致的视神经细胞丢失是青光眼重要的发生发展机制。青光眼通常伴随视网膜细胞Bcl-xl、Bax、cleaved-caspase-3等凋亡相关蛋白的下调或上调，通过抑制凋亡蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax能延缓视神经细胞损失。本实验进一步TUNEL染色和凋亡相关蛋白表达水平检测证实，抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl的表达在空白组中最高，在模型组中表达急剧下降，促凋亡因子Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax则正好相反。在活络效灵丹低、中、高剂量组中Bcl-2、Bcl-xl的表达较模型组上升(P<0.05)，cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax的表达较模型组下降(P<0.05)，且在高剂量组中效果最佳。对照组的表达趋势一直与空白组相似。说明活络效灵丹和注射用鼠神经生长因子能有效抑制细胞凋亡，活络效灵丹在一定程度上延缓视神经细胞损伤，抑制视网膜神经节细胞凋亡，以此保护青光眼兔视力，其中活络效灵丹高剂量组效果优于低、中剂量组。

PI3K能通过催化其底物磷脂酰肌醇的肌醇环发生磷酸化的方式，激活细胞中酶级联反应，调控各种不同细胞功能，包括代谢、生长、增殖、存活、转录及蛋白质合成，是生命活动的重要调节信号分子。Akt是PI3K信号通路下游的重要组成成分，是一种丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，与蛋白激酶A、蛋白激酶C的蛋白序列高度相似。Akt的氨基端有一个普列克底物蛋白同源物样域，能特异性结合底物的丝氨酸、苏氨酸残基，并使之磷酸化，这是Akt蛋白传导信号并介导信号分子间相互作用的主要方式。PI3K能催化Akt第308位苏氨酸及第473位丝氨酸发生磷酸化，从而介导后续的信号传递，调控核糖体、线粒体内质网等细胞系发挥抑制细胞凋亡等作用。有研究报道PI3K/Akt信号通路参与视网膜神经节细胞分化中神经突的生长，并且PI3K/Akt信号通路的激活在缺氧引起的视神经损伤模型中起到保护视神经的作用[15]。为进一步研究活络效灵丹降低青光眼兔视神经损伤的分子机制，我们对PI3K/Akt信号通路的蛋白表达水平进行了检测。结果：对照组、活络效灵丹高剂量组PI3K、Akt蛋白表达水平均高于模型组(P<0.05)，说明注射用鼠神经生长因子和活络效灵丹高剂量组激活PI3K/Akt信号通路，从而抑制视网膜神经节细胞凋亡，保护视力。故活络效灵丹可能通过激活PI3K/Akt信号通路，从而抑制视网膜神经节细胞凋亡，保护视力。

综上所述，活络效灵丹能降低复合卡波姆溶液诱发的青光眼兔眼压，降低视网膜细胞凋亡率，从而抑制视网膜损伤，PI3K/Akt信号通路激活可能是活络效灵丹治疗青光眼的分子机制。