红铃虫对Bt棉花的抗性现状及抗性机制

王 玲 王金涛 丛胜波 许 冬 万 鹏

（农业部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物病虫草害防控湖北省重点实验室/湖北省农业科学院植保土肥研究所武汉 430064）

红铃虫（Pectinophora gossypiella），属鳞翅目Lepidoptera麦蛾科Gelechiidae，是一种世界性的重要棉花害虫，以其幼虫危害棉蕾和花铃，导致棉铃内部的纤维受损或者造成蕾铃与棉籽脱落，使棉铃重量减轻、纤维品质下降甚至棉籽破碎［1］。2000年之前，红铃虫在我国长江流域棉区常年为害成灾，致使棉花产量损失10%～30%，严重影响了该区域的棉花生产［2］。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt），是一种革兰氏阳性菌，在产孢过程中产生具有杀虫活性的晶体蛋白［3］。自转Bt基因棉花商业化种植之后，为红铃虫等鳞翅目害虫的防治提供了新的有效的手段。随着Bt棉花的不断种植，红铃虫的种群数量得到了有效的控制［4］。然而，由于红铃虫是寡食性害虫，在棉田面临着持续的选择压力，对Bt棉花存在抗性演化的风险。事实上，世界范围内已发现一些田间红铃虫种群对Bt棉花产生了实质抗性，其抗性问题严重威胁着Bt棉花的持续使用。

1 红铃虫对Bt棉花的抗性现状

我国长江流域自2000年开始种植转Bt（Cry1Ac）基因棉花，随着Bt棉花的大面积推广应用，有效的抑制了红铃虫的发生与危害。然而，该区域并没有要求种植一定比例的非Bt棉花作为“庇护所”，随着Bt棉种植面积的增加，到2006年，非Bt棉花的种植比例首次下降到20%以下［4］。到2008～2009年，非Bt棉花的种植比例降至12%。直至2010年开始，F2代Bt棉花的种植比例大幅度上升，为红铃虫提供了23%的非Bt棉庇护所，此后非Bt棉花的比例常年维持在25%左右［4］。常年的抗性监测发现，2008～2010年长江流域棉区红铃虫对Cry1Ac的敏感性相对于2005～2007年有所下降，表现出早期预警［5］；而2011～2015年该区域红铃虫对Cry1Ac的敏感性相对于2008～2010又明显上升。此外，通过检测7种已知的抗性等位基因，发现2012～2015年这7种抗性等位基因的基因频率均处于较低水平，7种等位基因的总频率从2012年的0.0105（0.0084～0.0132）下 降 到 2015 年 的 0.0046（0.0031～0.0067），下降了2.3倍［6］。这说明“庇护所”对延缓红铃虫对Bt棉花的抗性演化是十分重要的，2006～2009年期间由于非Bt棉的比例极低，导致早期预警的发生，但随着2010年F2代Bt棉的大面积种植，提供了充足的非Bt棉庇护所，反转了红铃虫对Bt棉花的早期抗性，同时还减少了化学农药的使用［4］。因此，到目前为止，我国长江流域红铃虫对Bt棉花仍然保持着较好的敏感性（表1）。

表1 三个国家Bt棉花的种植及红铃虫田间抗性现状

美国亚利桑那州在引进Bt棉花之前，红铃虫的种群密度常年较高。自1996年开始种植转Bt（Cry1Ac）基因棉花，该区域的棉花种植者一直遵循法定的“庇护所”策略，部分田块用于种植非Bt棉花，使得该区域非Bt棉花的种植比例每年达25%以上［7］。到2005年，Bt棉花造成了红铃虫种群密度的区域性下降和广谱杀虫剂喷洒量的减少［8］。2003年，美国开始逐渐从单一种植转Bt（Cry1Ac）单价棉转向同时种植单价棉和转Bt（Cry1Ac+Cry2Ab）双价棉。常年对亚利桑那州田间种群进行室内生物测定及抗性等位基因检测，发现1997年～2005年，该区域的田间红铃虫种群对Cry1Ac的敏感性并没有下降（表1）［7］。从2006年开始，美国开始施行红铃虫根除计划，通过在田间释放大量辐射不育的成虫来延缓红铃虫对 Bt棉花的抗性［7，9］。自此，亚利桑那州的红铃虫种群数量急剧下降：田间非Bt棉上的红铃虫幼虫从2005年的15.3%下降到2009年的0.012%，下降了99.92%；而信息素诱集的成虫数量从2005年的每周26.7只下降至2009年的0.0054只，下降了99.98%［9］。2010年～2018年，亚利桑那州田间棉铃上未发现红铃虫幼虫；2013年～2018年，田间未发现野生的红铃虫成虫［10］。其他州的情况与亚利桑那州类似，最终美国农业部于2018年10月宣布红铃虫已在美国被根除［10］。

印度自2002年开始种植转Bt（Cry1Ac）基因棉，2006年开始引进转Bt（Cry1Ac+Cry2Ab，Bollgard II）双价棉。虽然印度基因工程批准委员会（GEAC）要求种植20%非Bt棉花作为庇护所以延缓抗性发展，但印度农户并没有严格执行。2014年，印度转Bt棉花的种植面积已达棉花种植总面积的 95%，而 Bt棉中 96%为转 Bt（Cry1Ac+Cry2Ab）双价棉，而转Bt（Cry1Ac）单价棉仅占4%［11］（Choudhary和Gaur，2015年）。与美国和中国对Bt棉花的持续敏感性不同，在印度，由于非Bt棉庇护所非常稀少，红铃虫迅速发展出对Bt棉花的实际抗性［12，13］。2008年，首次记录了印度古吉拉特邦田间红铃虫种群对Cry1Ac产生抗性（表1）［14］。2014年，来自印度中部的8个田间种群对Cry1Ac和Cry2Ab的平均抗性倍数分别为310和78，而且转Bt（Cry1Ac+Cry2Ab）双价棉棉铃上的幼虫侵染率（52%）高于非Bt棉上的幼虫侵染率（27%）［13］。到 2015年，红铃虫对转Bt（Cry1Ac+Cry2Ab）双价棉产生抗性在印度棉区已经普遍存在［13］。

2 红铃虫对Bt的抗性机制

红铃虫对Bt的抗性机制目前可以归为两类，一种是对Cry1Ac的抗性，目前已报道的所有室内或者田间红铃虫Cry1Ac抗性品系或者抗性个体均有钙粘蛋白基因（PgCad1）介导，尚未发现其他基因介导红铃虫对Cry1Ac的抗性。总共报道了17种不同的PgCad1抗性等位基因［15-22］，这些抗性等位基因全部涉及PgCad1的突变，只有r17还涉及了PgCad1的表达量下调（表2）。在这17种抗性等位基因中，有9种抗性等位基因（r5、r7-r12、r15、和r17）发生了可变剪切或错误剪切，产生2～4种不同的转录本［18，21，22］；说明可变剪切或错误剪切在红铃虫PgCad1抗性等位基因中是普遍存在的。抗性等位基因r3、r15和r16均发生了转座子的插入，其中r3等位基因在第21个外显子插入一个4739 bp的非LTR反转录转座子［23］，r16等位基因在第20个外显子插入一个1545 bp的退化转座子［20］，r15等位基因最为特殊，在第28个外显子插入了一个3370 bp的片段，该插入片段是一种MITE转座子，且MITE转座子中包含了另外2次转座子插入事件，插入了SINE与RTE这2种转座子［21］，这说明转座子插入也是导致红铃虫PgCad1突变的重要因素。所有的PgCad1抗性等位基因均编码产生结构不完整的钙粘蛋白，涉及除胞内区之外的各个区域，包括信号肽、钙粘蛋白重复区域、近膜区以及跨膜区的变异，以钙粘蛋白重复区域的变异为主，这些结构不完整的钙粘蛋白与Cry1Ac的结合能力下降或者定位错误，从而导致红铃虫对Cry1Ac产生抗性［19-21］。此外，抗性等位基因r17的转录水平相对于敏感型PgCad1显著下调79～190倍，这也是导致红铃虫对Cry1Ac产生抗性的重要原因［22］。

表2 红铃虫钙粘蛋白抗性等位基因及其介导Cry1Ac抗性的机制

另一种是对Cry2Ab的抗性，与ABC转运蛋白ABCA2基因（PgABCA2）的变异相关。美国室内筛选的Cry2Ab抗性品系及印度田间的Cry2Ab抗性个体，均有由PgABCA2错误剪切导致［24］。完整的内含子被保留、5′或3′的剪切位点被替换以及外显子跳跃是导致PgABCA2发生错误剪切的主要原因，目前以及发现20种以上不同的剪切形式，主要涉及外显子4、6、8、14与20，其中错误剪切导致外显子6缺失在室内抗性品系与田间抗性个体中均有发生［24］。值得一提的是，在红铃虫中，Cry1Ac和Cry2Ab之间的交叉抗性是不对称的，PgCad1突变的Cry1Ac抗性品系对Cry2Ab几乎没有交互抗性［19-21］，而Cry2Ab抗性品系却对Cry1Ac存在交互抗性［25］。

3 展望

在中国、美国和印度，红铃虫对Bt棉花的抗性演化存在惊人的差异，这说明合理有效的抗性治理策略对延缓害虫的抗性发展至关重要。制定合理有效的抗性治理策略，依赖于对Bt与害虫互作机制的掌握。就红铃虫而言，目前无论是室内的抗性品系，还是田间的抗性个体，都由PgCad1的不同突变形式介导Cry1Ac抗性，这说明PgCad1在Cry1Ac对红铃虫的作用过程中是一个极为敏感的步骤，容易发生变异而导致抗性的发生。虽然来自三个国家的红铃虫Cry1Ac抗性品系或个体都与PgCad1突变相关，但PgCad1突变的形式并不完全相同，这可能是由于三个国家Bt棉花的种植模式不同，红铃虫受到的筛选压力并不相同，从而导致田间种群的抗性演化有所差异。此外，PgCad1与PgABCA2的突变形式如此多样化，也说明了田间抗性的发展是极其复杂的，田间很可能还存在更多的突变形式；也可能存在其他抗性基因介导红铃虫对Cry1Ac或者Cry2Ab的抗性甚至介导二者的不对称交互抗性，只有进一步深入了解这些抗性基因的类型及其对Bt抗性的贡献大小与机制，才能有针对性的制定合理的抗性治理策略以继续延缓红铃虫对Bt棉花抗性的发展。