叶酸靶向超声纳米造影剂的制备及其细胞孵育装置的设计

李 莹，刘 威，廖秀玉（通讯作者）

（1福建医科大学附属第一医院重症医学科 福建 福州 350005）

（2福建中医药大学附属人民医院麻醉科 福建 福州 350005）

癌症近年来已经成为临床上危害全世界人类健康的主要疾病之一，而癌细胞被检测出的越早，则治愈的可能性就越高。研究表明癌症可以实现早期检测，则将有30%的癌症患者得以生存，超声分子成像技术近年来得到长足的发展。叶酸及其还原产物是真核细胞核酸合成过程必不可少的原料，可特异性地与细胞表面糖基磷脂酰肌醇连接的叶酸受体结合。叶酸受体在正常细胞表面的表达非常有限，而在肿瘤细胞表面常存在过表达，如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等，叶酸受体的特异性分布为肿瘤的靶向造影和靶向治疗提供了可能性，也极大程度地降低了对正常组织的影响[1]。本实验采用价格低廉、无细胞毒性、生物相容性较好的N-软脂酰基壳聚糖（N-palmitoyl chitosan，PLCS）共价连接叶酸制备了叶酸靶向超声纳米造影剂[2]，粒径均匀，靶向性可靠。本实验还成功实现叶酸纳泡与叶酸受体高表达的Hela细胞的共孵育，望用其作为分子探针对叶酸受体高表达的肿瘤进行超声分子成像。

1 材料与仪器

剪切仪（IKA ULTRA-TURRAX T25，德国IKA公司）；全氟丙烷（广东佛山捷和气体有限公司）；马尔文粒度分析仪（ZS Nano S，英国Malvern公司）；共聚焦成像系统（FluoView FV10i，Olympus，日本）；透射电镜（FEI TECNAI SPIRIT G2，美国）；扫描电镜（FEI QUANTA 200，美国）；35mm×12mm玻底培养皿（耐思生物科技有限公司，中国）；100mm×20mm培养平皿（康宁，中国）；25cm2透气培养瓶（康宁，中国）；HeLa细胞（行知生物科技有限公司，中国）；叶酸（华南农业大学资源环境学院提供）；DMSO（PanEra，中国）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma，美国）；DiO 细胞膜绿色荧光探针（碧云天，中国）；RPMI 1640培养基（gibco，美国）；胎牛血清（hyclone，南美洲）；0.25%胰酶（gibco，美国）；N-软脂酰基壳聚糖/叶酸-N-软脂酰基壳聚糖（华南农业大学资源环境学院提供）。

2 方法

2.1 纳泡制备

2.1.1普通N-软脂酰基壳聚糖纳泡/叶酸-N-软脂酰基壳聚糖纳泡（以下简称C-NBs/F-NBs）的制备

将适量N-软脂酰基壳聚糖/叶酸-N-软脂酰基壳聚糖等膜材料加入20ml蒸馏水中，在50℃水浴条件下轻轻搅拌至完全溶解，置入50ml注射器内，注射器头端以三通管连通C3F8氟碳气体。将剪切仪置人注射器内至液面下2.5cm处，在通入氟碳气体的同时，以剪切仪第5档（21000r/min）剪切40s后，转第6档（24000r/min）剪切7min。纳泡制备后分装入青霉素瓶中，填充氟碳气体并密封瓶口，4℃保存备用。

2.1.2 DiO荧光N-软脂酰基壳聚糖纳泡（DiOencapsulated NBs）制备

为了在荧光下更好地观察N-软脂酰基壳聚糖纳泡（NBs），我们将荧光探针DiO连接到NBs表面，制备DiO-encapsulated NBs，方法如下：将适量N-软脂酰基壳聚糖或叶酸-N-软脂酰基壳聚糖加入20ml蒸馏水中，在50℃水浴条件下轻轻搅拌至完全溶解。下述步骤尽量避光操作：取适量DiO溶解于DMSO中（1mg/ml），用注射器吸取DiO/DMSO溶液，逐滴缓慢加入溶解的N-软脂酰基壳聚糖或叶酸-N-软脂酰基壳聚糖溶液中，同时轻轻搅拌使DiO与壳聚糖充分混合；将上述溶液置入50ml注射器内，注射器头端以三通管连通C3F8氟碳气体。以下步骤与普通纳泡制备方法相同，将装有荧光纳泡的青霉素瓶以锡纸包裹后放于4℃避光保存。

2.2 纳泡基本特征的观察和测定

纳泡制备后24小时进行下列检测：将纳泡轻轻摇匀，取一小滴加至载玻片上，普通光学显微镜及荧光显微镜下观察纳泡的外观形态；以透射电镜（Transmission electron microscopy，TEM）检测纳泡之前，先进行甲胺钨酸盐染色：纳泡混悬液滴在表面镀了碳膜的铜网（200目）上，自然干燥5min后，以滤纸轻轻吸干铜网上残余的液体，然后把铜网浸泡在甲胺钨酸盐的缓冲溶液中，染色1min，清水中漂1～2次，室温下晾数分钟，透射电镜下观察纳泡的内部结构；扫描电镜（Scanning electron microscopy，SEM）观察纳泡表面形貌：纳泡混悬液滴在表面镀了碳膜的铜网（200目）上，室温下干燥，镀以钯-铂金属膜；共聚焦显微镜下观察F-NBs及C-NBs，明确叶酸是否成功地连接至壳聚糖纳泡表面：纳泡悬液稀释后滴于载玻片上，以盖玻片覆盖，共聚焦显微镜下进行观察，激发光波长为365nm，发射波长为450nm；马尔文粒度分析仪检测纳泡的大小：100μl纳泡稀释至5ml，倒入检测池中，以532nm的激光垂直照射样品池，检测器与入射光的角度为90°；Zeta电位仪分析纳泡表面电位：纳泡混悬液用去离子水稀释；细胞计数板计数纳泡的浓度。

2.3 纳泡与细胞共孵育

本实验中HeLa细胞为贴壁细胞，可通过如下方法实现纳泡与细胞的共孵育。

接种于25cm2透气培养瓶的细胞：①细胞贴壁后，去除培养液，PBS冲洗后加入适量纳泡，以RPMI 1640培养基加满整个培养瓶以排尽瓶内气体，拧紧瓶盖，上下颠倒数次使纳泡在培养基中均匀分布，避免剧裂振荡；②将上述培养瓶倒置于37℃细胞培养箱中，纳泡上浮后可与细胞充分接触，达到孵育的目的（图1A）。

接种于35mm×12mm玻底培养皿的细胞：①准备一个100mm×20mm培养平皿，加入适量的培养基，再加入适量的纳泡，充分混匀；②细胞贴壁后，去除培养液，PBS冲洗，将玻底皿倒扣于前述100mm×20mm培养平皿，以自制抽气装置将玻底皿内气体抽尽使细胞完全浸润于培养基中，如图1B～D所示。

图1 NBs与细胞共孵育的装置（A：接种于25cm2透气培养瓶的贴壁细胞与NBs共孵育示意图；B：自制抽气装置，将输液针头折弯形成约120°夹角，如红色圆圈所示；C：玻底皿内气体被抽出前；D：玻底皿内气体被抽出后）。

2.4 共聚焦成像

将接种于玻底培养皿的HeLa细胞与DiO-encapsulated F-NBs孵育30min，去除培养基，PBS冲洗，再次加入新鲜的培养基，在共聚焦显微镜下观察细胞与纳泡的情况。

3 结果

3.1 纳泡外观形态和理化特性

F-NBs/C-NBs/DiO-encapsulated NBs制备后呈淡黄色/白色/橙黄色的混悬液，静置24h后，上层为约2～3mm的淡黄色/白色/橙黄色纳泡聚集层，下层为透明溶液（图2-1A），轻轻摇匀后造影剂呈均匀毛玻璃样混悬液（图2-1B）。普通光学显微镜观察，纳泡呈透亮球形，粒径小，大小较均一，分布均匀，彼此无聚集现象（图2-1C），荧光显微镜观察，DiO-encapsulated NBs呈绿色圆环状（图2-1D）。透射电镜图（图2-1E）及扫描电镜图（图2-1F）清楚地显示N-软脂酰基壳聚糖纳泡的内部结构（壳聚糖外壳+中心空腔）和表面形貌。

共聚焦显微镜下观察F-NBs及C-NBs，激发光波长为365nm，发射波长为450nm，F-NBs表面带蓝色荧光，荧光分布均匀，而C-NBs表面无荧光，说明靶分子叶酸成功连接到纳泡表面，且叶酸分布均匀，F-NBs构建成功（图2-2）。

马尔文粒度分析仪测得纳泡平均粒径为（617±12）nm（图2-3A），Zeta电位仪测定表面电位为（55.3±2.1）mV（图2-3B），计数板计算纳泡浓度约为（7.2±0.6）×109/ml。

图2-1 纳泡外观形态（A：NBs制备后静置24小时大体形态；B：NBs摇匀后大体形态，A、B图由左至右依次为F-NBs、C-NBs及DiO-encapsulated F-NBs；C：NBs在普通显微镜下所见形态；D：DiOencapsulated F-NBs在荧光显微镜下所见形态；E、F：NBs的透射电镜图及扫描电镜图；C、D、E、F图左上角均为局部放大图）。

图2-2 共聚焦显微镜下观察F-NBs及C-NBs（A：F-NBs表面呈蓝色荧光，说明叶酸已成功连接到NBs表面；B：F-NBs在明场下所见；C：C-NBs表面无荧光；D：C-NBs在明场下所见）。

图2-3 纳泡粒径及表面电位分布（A：马尔文粒度分析仪所测得纳泡的粒径分布；B：Zeta电位仪所测得纳泡的表面电位）。

3.2 DiO-encapsulated F-NBs与Hela细胞共孵育后的共聚焦成像

在共聚焦显微镜下可见，Hela细胞形态正常，分布均匀，细胞间紧密结合，可见较多DiO-encapsulated F-NBs粘附在细胞表面，部分散在分布在细胞质内，纳泡结构完整（图3A、3B）。

图3 DiO-encapsulated F-NBs与Hela细胞共孵育后的共聚焦成像

4 结论

近年来，临床上恶性肿瘤发病率一直有升高的趋势，而且恶性肿瘤致死率高，如何能在早期诊断中确诊，如何做到靶向治疗是目前医学研究的热点。本实验将叶酸共价连接到N-软脂酰基壳聚糖上，结合稳定，F-NBs制备过程中叶酸不易丢失和改变构象，可良好解决靶向造影剂生物连接中配体产率和配体靶向活性的问题。实验材料叶酸、壳聚糖来源丰富、价格便宜，且无毒副作用，生物相容性好。

研究表明疾病状态时内皮细胞间隙会出现变化，如肿瘤新生血管的间隙较大，大部分肿瘤新生血管允许700nm以下的粒子通过[3]，F-NBs粒径小，可以通过肿瘤血管内皮间隙进入血管外组织间隙，而叶酸与叶酸受体有效特异的结合，使F-NBs有望作为分子探针对叶酸受体高表达的肿瘤进行靶向超声分子成像[4]。

微泡/纳泡具有良好的药物和基因包载功能，可设计单靶点、多靶点、多功能和多模式的分子探针等。因此，有效跨越血管内皮屏障的靶向纳泡的成功构建，为使超声分子成像技术能全面实现在活体中从分子水平定位、定量和可视化研究疾病发生和发展的规律，以及为疾病的早期预警诊断和干预效果监测提供了可能。以靶向超声纳泡为基础可设计出载药靶向纳泡，以及可设计出具有诊断和治疗功能的载药靶向微泡/纳泡/纳米粒复合剂，具有靶向治疗的潜在价值。