针灸对溃疡性结肠炎大鼠维生素D受体及p53信号通路调节作用的研究

李晗　李昆珊　吴璐一　周志刚　黄任佳　吴焕淦　刘雅楠　黄艳　马晓芃　刘慧荣　陆嫄

摘要 目的：維生素D（VD）缺乏与溃疡性结肠炎（UC）发病相关，针灸对UC有显著的疗效，起效机制尚未完全阐明，因此我们从维生素D受体（VDR）及与VDR相关的p53信号通路角度，观察针灸对UC大鼠调节的作用机制。方法：采用3%DSS制备UC大鼠模型。将大鼠随机分为正常组，模型组，电针组，隔药灸组和维生素D组。对双侧天枢穴采用电针或隔药灸干预1周，维生素D灌胃1周。分析大鼠结肠黏膜形态并评分，采用免疫组织化学法和QPCR检测结肠VDR蛋白和mRNA的表达，Western blotting检测结肠p53、PUMA和Caspase-3蛋白的水平。结果：与正常组比较，模型组组织病理学评分显著升高，经电针、隔药灸和VD干预后各组显著降低;与正常组比较，模型组VDR蛋白和mRNA表达显著降低，p53、PUMA和Caspase-3蛋白表达显著升高，与模型组比较，电针组、隔药灸组和维生素D组的VDR蛋白和mRNA表达显著升高，p53、PUMA和Caspase-3蛋白表达显著降低。结论：电针、隔药灸可以显著改善UC大鼠结肠黏膜炎性反应，该效应可能与针灸对VDR及下游p53信号通路的调节作用有关。

关键词 溃疡性结肠炎;针刺;艾灸;维生素D受体;p53信号通路

Study on the Regulatory Effects of Acupuncture on Vitamin D Receptor and p53 Signal Pathway in Ulcerative Colitis Rats

LI Han1，2，LI Kunshan1，WU Luyi1，ZHOU Zhigang3，HUANG Renjia1，WU Huangan1，LIU Yanan4，HUANG Yan1，4，MA Xiaopeng1，4，LIU Huirong1，4，LU Yuan1，4

（1 Key Laboratory of Acupuncture-Moxibustion and Immunological Effects，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200030，China; 2 The Center of Neck And Low Back Pain，Changzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Changzhou Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Changzhou 213002，China; 3 International Education College，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China; 4 Department of Acupuncture and Moxibustion Immunization Laboratory，Shanghai Research Institute of Acupuncture and Median，Shanghai 200030，China）

Abstract Vitamin D deficiency has closely relationship with ulcerative colitis（UC）.Acupuncture has significant effects on UC，and the mechanism of action has not yet been fully elucidated.Therefore，we are to observe the regulatory mechanism of acupuncture on UC rats from the perspective of vitamin D receptor（VDR）and the p53 signaling pathway related to VDR.Methods：The UC rat model was prepared with 3% DSS.The rats were randomly divided into a normal group，a model group，an electroacupuncture group，a medicine-separated moxibustion group and a vitamin D group.Electroacupuncture or medicine-separated moxibustion was used to intervene in bilateral Tianshu points for one week，and vitamin D was given for gavage for one week.The morphology of the rat colon mucosa was analyzed and scored.The expression of VDR protein and mRNA in the colon was detected by immunohistochemistry and QPCR，and the levels of p53，PUMA and Caspase-3 protein in the colon were detected by western blotting.Results：Compared with the normal group，the histopathological score of the model group was significantly increased，and the groups were significantly reduced after electroacupuncture，medicine-separated moxibustion，and VD intervention; compared with the normal group，the expression of VDR protein and mRNA in the model group was significantly reduced.The expression of p53，PUMA and Caspase-3 protein was significantly increased.Compared with the model group，the expression of VDR protein and mRNA in the electroacupuncture group，the medicine-separated moxibustion group and the vitamin D group were significantly increased，and the expression of p53，PUMA and Caspase-3 protein was significantly decreased.Conclusion：Electroacupuncture and medicine-separated moxibustion can significantly improve the inflammatory response of colonic mucosa in UC rats.This effect may be related to the regulation of VDR and downstream p53 signaling pathway by acupuncture.

Keywords Ulcerative colitis; Acupuncture; Moxibustion; Vitamin D receptor; p53 signaling pathway

中图分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.012

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是一种目前病因未明的慢性非特异性肠道疾病，临床表现为持续或反复发作的腹泻、粘液脓血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身症状[1]。UC的治疗主要采用氨基水杨酸制剂和糖皮质激素[2]，临床上已经取得了较好的治疗效果，但是不良反应的报道也屡见不鲜。针灸作为中医学重要的治疗方法，对UC的辅助治疗有确切的疗效[3-6]，但起效机制尚未完全阐明。

研究表明，维生素D缺乏与UC的发生和发展存在较为紧密的联系[7-8]。因此，国内外学者越来越重视维生素D在UC发病中的作用与意义[9-10]。我们课题组前期研究表明，隔药灸可以显著促进UC大鼠血清和结肠组织中维生素D及其受体（Vitamin D Receptor，VDR）的表达，降低结肠IFN-γ、TNF-α等细胞因子的表达[11]。p53基因是人体抑癌基因，目前认为p53主要调控炎性反应、肿瘤的发生和发展[12]，当炎性反应发生时，p53的激活可加重炎性反应的发生。研究表明：UC模型结肠组织的p53被激活，呈现高表达[13]。PUMA是p53的下游靶基因，是促炎启动基因，体内各种感染炎性反应会诱发细胞依赖p53及非依赖p53机制，诱导PUMA表达增多，且PUMA表达与UC模型内炎性反应严重程度呈线性关系[14]。本课题组长期致力于针灸治疗UC的临床和实验研究，证实针灸在改善UC患者临床症状，抗炎，调节免疫等方面具有显著的优势[15-17]。本次研究，旨在从维生素D受体VDR和p53信号通路的角度探讨针灸对UC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 5周龄雄性SD清洁级大鼠32只，体质量（150±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002，室内环境温度控制在（20±2）℃，湿度50%～70%，照明：12 h光照/12 h黑暗。实验中所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）及上海市实验动物伦理委员会的规定（实验动物伦理审批号：SZY201707014）。

1.1.2 试剂与仪器 DSS（MPBiomedicals，美国，货号：MPbio.0216011080），骨化三醇胶丸（R.P.Scherer GmbH & Co.KG，瑞士，国药准字J20150011），戊巴比妥钠（Merck，德国，货号：P-010），甲醛（上海国药集团，货号：M0130-2363），VDR抗体（Abcam，美国，货号：ab3508），p53抗体（Abcam，美国，货号：ab26），PUMA抗体（Abcam，美国，货号：ab9643），Caspase-3抗体（Abcam，美国，货号：ab13847）。Trizol（Invitrogen，美国，货号：10296010），逆转录试剂盒（天根公司，货号：KP203-02），SYBR GREEN荧光定量试剂盒（天根公司，货号：FP314-02）。酶标仪（Thermo Fisher，美国，型号：MultiskanFC），石蜡包埋机（Leica，德国，型号：EG1150），切片机（Leica，德国，型号：RM2245），韩氏穴位神经刺激仪（南京济生医疗科技有限公司，型号：Hans-200），光学显微镜（OLYMPUS，日本，型号：CX23），PCR仪（ABI公司，美国，型号：2720）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 大鼠随机选取7只作为正常组大鼠（Normal Group，N），其余25只为造模大鼠。采用3%DSS水溶液自由饮用的方法制备UC大鼠模型[18]。造模大鼠于第1周、第3周，自由饮用3%DSS水溶液，第2周、第4周，常规饲养。见图1。第4周后，随机取1只正常大鼠、1只造模大鼠进行模型鉴定。24只造模大鼠随机分为模型组（Model Group，M），电针组（Electro-acupuncture Group，EA），隔药灸组（Herb-partitioned Moxibustion Group，HM）和维生素D组（Vitamin D Group，VD），每组6只。

1.2.2 干预方法 正常组和模型组不做治疗，只做与其他3组相同的固定，连续7 d。电针组采用一次性无菌针灸针，直刺大鼠双侧天枢穴（ST25）（脐中旁开5 mm，针刺2 mm）[19-20]，针柄连接韩氏穴位神经刺激仪，采用疏密波，频率2/100 Hz，电流1 mA，留针10 min，治疗1次/d，共针7次。隔药灸组予双侧天枢穴（ST25）隔药灸，艾炷大小约90 mg;药饼配方：附子、肉桂等，药饼厚约0.5 cm，直径1 cm;灸1次/d，每次每穴灸2壮，每壮燃烧时间5 min，2壮燃烧时间为10 min，共灸7次。维生素D组予1，25（OH）2D3灌胃：将0.25 μg/粒的骨化三醇胶丸（4粒）溶于15 mL的橄榄油，每只大鼠每天灌胃0.5 mL的混合液，连续灌胃7 d[21]。所有大鼠经4%戊巴比妥钠过量麻醉处死，取出大鼠结直肠纵行剪开，取自肛门向上6 cm肠段观察，剪取其中1 cm置于4%多聚甲醛固定，其余置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 检测指标与方法

1）HE染色：组织放入包埋机进行石蜡包埋，切片机连续切片（厚度为4 μm），脱蜡水化后进行苏木素-伊红染色，中性树胶封片。评分参照Hofman P等人的方法[22]。2）免疫组化：结肠组织切片脱蜡水化后，采用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液进行抗原修复，自然冷却后0.02 mol/L PBS洗3 min×3次;将玻片置于3%H2O2中，湿盒孵育10 min，0.02 mol/L PBS冲洗3 min×3次。根据说明书和预实验结果，添加稀释后的抗体，VDR（1∶200）。湿盒孵育，4 ℃孵育过夜，0.02 mol/L PBS冲洗3 min×3次，滴加DAB显色液，苏木素染色5 min，1%盐酸乙醇分化，显微镜下观察，控制染色程度，中性树胶封片。显微镜下拍照，采集图像，Image Pro Plus软件分析累积光密度，计算IOD值。3）Western Blot：a.蛋白浓度测定：结肠组织剪碎，加入蛋白裂解液后离心，提取上清液，使用酶标仪测定蛋白浓度;b.电泳：依据说明书制备SDS-PAGE凝胶，目标蛋白样品根据实验所需浓度稀释，于100 ℃沸水中水浴加热10 min，使蛋白充分变性，上样。冷却至室温，样品于浓缩胶以80 V×30 min，于分离胶120 V×60 min跑胶分离;c.转膜：采用半干转。以滤纸、胶体、膜、滤纸的方式制成三明治，用电转缓冲液浸润后，直接置于电转仪的正负极之间，NC膜和胶体于转膜前置于电转缓冲液中平衡5 min;d.封闭：5%脱脂奶粉室温封闭1 h;e.一抗、二抗孵育：依据说明书和预实验结果稀释一抗（p53，1∶1 000;PUMA，1∶1 000;Caspase-3，1∶500），加入稀释液中，4 ℃孵育过夜。一抗的膜用TBST洗滌3次，5 min/次。按照1∶1 000稀释HRP标记的二抗，加入二抗后37 ℃孵育1 h。用TBST洗涤3次，5 min/次;f.显色：采用ECL发光液，显色，放入成像系统扫描;g.数据提取：使用Image Pro Plus软件分析灰度值，计算目的蛋白和内参蛋白的比值，作为最终结果。4）实时定量PCR：将-80 ℃冻存的结肠组织，使用Trizol提取mRNA，经氯仿分离、异丙醇纯化、75%乙醇洗涤后，ddH2O溶解mRNA。使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，使用SYBR GREEN荧光定量试剂盒于PCR仪上进行相关mRNA表达量的检测。主要检测直肠组织VDR mRNA的表达。具体引物设计见表1，反应条件为95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，一共40个循环。每个样本做2个复孔，采用公式△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，计算得出每个基因的△Ct，再通过换算得出每个基因相对表达量=2-△△Ct。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0进行统计分析，对计量资料进行正态分布检验，若服从正态分布，结果以均数±标准差（±s）表示;若不服从正态分布，则采用中位数（上四分位数，下四分位数）[Median（P25，P75）]表示。正态分布的资料组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐则采用最小显著差异法（LSD检验）进行两两比较;方差不齐则采用新复极差法检验（Dunnett-t检验）进行两两比较。若资料不服从正态分布则采用秩和检验（Kruskal-Wallis test）。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针灸可降低UC大鼠结肠组织病理学评分

正常组大鼠结肠上皮细胞形态正常，腺体排列整齐，黏膜结构完整，无组织充血、水肿和溃疡。模型组大鼠结肠上皮结构破坏，腺体缺失，黏膜结构不完整，炎性细胞大量浸润。与模型组比较，电针组、隔药灸组和维生素D组大鼠结肠上皮细胞结构较完整，腺体排列较整齐，炎性细胞浸润少。见图2A。

病理评分显示，与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜病理评分显著增高（P<0.001），与模型组比较，电针组、隔药灸组和维生素D组病理评分显著减低（P<0.001）。见图2B。

2.2 针灸可上调UC大鼠结肠黏膜VDR蛋白和mRNA表达

与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜VDR蛋白表达和mRNA水平显著降低（P<0.001），与模型组比较，电针组、隔药灸组和维生素D组VDR蛋白表达和mRNA水平显著升高（P<0.001）。见图3A、B、C。

2.3 针灸可上调大鼠结肠黏膜p53通路中p53、PUMA和Caspase-3蛋白表达

与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜p53、PUMA和Caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.001），与模型组比较，电针组、隔药灸组和维生素D组的p53、PUMA和Caspase-3蛋白表达水平显著降低，其中维生素D组p53，P<0.05，其余P<0.001。见图4。

3 讨论

形态学观察显示，与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜损伤及炎性细胞浸润程度均较重，经电针、隔药灸和VD干预后，黏膜损伤和炎性细胞浸润均显著改善。病理评分结果，模型组较正常组评分显著升高，3组观察组评分较模型组均显著降低，说明针灸可以改善UC大鼠结肠黏膜损伤，减轻结肠黏膜炎性反应。该效应是否与VDR及其相关信号通路有关是本次研究要探寻的答案。皮肤中的7-脱氢胆固醇经由阳光中的紫外线，转化为维生素D3，后者再经过肝脏、肾脏的作用，在肾脏被1α羟化酶CYP27B1转化为1，25（OH）2D3[23]。1，25（OH）2D3在细胞内与VDR结合，激活多种细胞因子，发挥生物学作用。我们发现模型组大鼠结肠黏膜的VDR蛋白表达与正常组比较显著降低，这与已有的临床研究结果一致[24]，电针，隔药灸和维生素D均能显著增加UC大鼠结肠的VDR表达。提示各观察组大鼠结肠黏膜损伤的减轻与电针、隔药灸和补充维生素D提高VDR蛋白表达有关。

由于VDR在UC發病中与炎性反应密切相关，所以我们选择了与炎性反应调控和VDR均有关联的p53信号通路中的部分蛋白进行观察。研究人员采用western-blot技术，证实细胞质中p53是VDR的“结合伴侣”之一[25]。而在UC结肠组织中，Caspase-3的高表达和UC的发生、发展紧密相关[26]。Caspase-3蛋白属于Caspase家族，是细胞凋亡最为关键的执行者。在受到炎性反应等因素刺激时，即被激活。p53、PUMA在诱导细胞凋亡的过程中，引起线粒体功能障碍和Caspase-3激活，通过阻滞细胞周期、破坏细胞平衡状态、解体细胞组织等方式进入凋亡进程。Caspase-3水平的显著下降可以抑制细胞凋亡的发生[27]。在本项研究中，我们发现UC模型组大鼠结肠黏膜p53蛋白、PUMA和Caspase-3表达显著增多，经电针、隔药灸和维生素D干预后，表达均显著降低，提示电针和隔药灸可能通过调控p53通路中的p53、PUMA和Caspase-3，介导抗炎、抑制肠上皮细胞凋亡，保护肠黏膜屏障，缓解结肠炎性反应，改善结肠黏膜溃疡。

本研究首次以VDR为切入点，并首次通过观察与VDR和p53通路的p53、PUMA和Caspase-3在UC大鼠结肠的表达情况，电针和隔药灸干预后的表达情况，拟阐释电针和隔药灸对UC大鼠的部分起效机制。本研究结果首次发现，电针和隔药灸能显著增加UC大鼠结肠的VDR表达水平，降低p53、PUMA和Caspase-3的水平，提示该作用可能是电针和隔药灸干预UC大鼠的起效机制之一。本研究尚存在不足之处，如受实验条件限制，未做基因敲除等反向验证工作，电针和隔药灸对VDR的调控是直接作用还是间接影响不能明确，这将在后续研究中开展。

综上所述，通过本次研究，我们发现电针、隔药灸可以显著改善UC大鼠结肠黏膜炎性反应，该作用可能与升高VDR表达水平，降低p53、PUMA和Caspase-3的表达有关。

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（2020-05-07收稿 責任编辑：徐颖）

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81674074）——基于VDR信号通路探讨艾灸对UC肠道抗菌肽的调控机制研究;上海市卫生计生委优秀人才培养计划项目（2018YQ11）——艾灸干预溃疡性结肠炎E3泛素连接酶TRIM31的免疫调节机制;上海市卫生计生委科研课题青年项目（20164Y0221）——基于VDR信号通路探讨艾灸对UC肠道抗菌肽的调控机制研究作者简介：李晗（1987.03—），男，博士，主治医师，研究方向：针灸作用机制研究，E-mail：long-1987@126.com通信作者：陆嫄（1986.12—），女，博士，助理研究员，研究方向：针灸治疗炎症性肠病的临床与机制研究，E-mail：luyuan_sh@163.com;刘慧荣（1976.07—），女，博士，研究员，博士研究生导师，研究方向：针灸治疗胃肠疾病的临床与机制研究，E-mail：lhr_tcm@139.com