高频重复经颅磁刺激预处理对全脑缺血大鼠再灌注损伤的影响

任丽君，吴碧华 ，刘俊，张梅，杨兴

1.川北医学院附属医院老年科，四川 南充 637000；2.广安职业技术学院医学院，四川 广安 638000

1986年，MURRY等[1]首次提出了缺血耐受现象。1990年，KITAGAWA等[2]发现，全脑1次短暂性缺血可以对再次致死性缺血损伤有明显的保护作用，证实了脑缺血耐受现象的存在，第一次短暂脑缺血称为缺血预处理。随后越来越多的研究报道了缺血预处理的脑保护作用，如缺氧[3]、低温[4]、皮层扩散性抑制[5]、远隔器官缺血[6]、电针[7]、化学物质[8]均可以诱导脑缺血耐受。然而，这些预处理方法大多会对机体造成潜在的伤害，因此寻找较为安全的预处理方法尤为重要。

重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)是将一定频率和强度的磁脉冲以成串刺激的方式以一定时间间隔连续发放，由于其安全无创常用于治疗方面的研究。本研究团队前期实验发现，对全脑缺血大鼠进行连续两周的高频rTMS刺激，大鼠的学习记忆能力得到改善[9]。本实验将进一步探讨高频rTMS刺激预处理对全脑缺血大鼠再灌注脑损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型制备 成年雄性SD大鼠，体质量(230±20)g，均购自川北医学院动物实验中心[许可证号：scxk(川2008-18)]，随机区组法分为对照组、模型组、rTMS预刺激3次、rTMS预刺激7次，每组10只。模型组和rTMS预刺激组采用改良四血管阻断法(4-VO法)[10]造模，凝闭双侧椎动脉，24 h后夹闭双侧颈总动脉15 min，松开动脉夹后恢复血流灌注，制备全脑缺血再灌注损伤模型。

1.2 高频rTMS刺激 磁刺激频率10 Hz，100个脉冲/串，12串/d，每串间隔30 s，刺激强度为0.5 T。脑缺血再灌注模型与磁刺激间隔为48 h，rTMS预刺激组分别于造模前给予磁刺激3次和7次。

1.3 改良神经功能评分 再灌注24 h后，采用改良神经功能缺损评分(mNSS)[11]评估大鼠神经功能损伤程度。mNSS评分包括行动能力测试、感觉测试、反射测试3大项，14小项，总分14分。评分越低，损伤程度越轻。

1.4 血脑屏障通透性 对大鼠进行mNSS评分，然后用10%水合氯醛(3.8 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后，尾静脉注射2%伊文思蓝4 mL/kg。2 h后心脏灌流，冰盒上迅速分离脑组织，将脑组织9 mL/g浸入甲酰胺溶液中，45℃避光孵育72 h，15 000 r/min离心20 min，取上清。酶标仪测量光密度(optical density，OD)值，根据标准曲线读出伊文思蓝浓度。

1.5 蛋白免疫印迹法 大鼠麻醉后迅速断头取脑，分离海马组织，将组织研磨后加入蛋白裂解液，取上清液，用二喹啉甲酸法进行蛋白定量，然后进行电泳、转膜和封闭，在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上分别滴加1∶5 000兔抗鼠BDNF、1∶1 000兔抗鼠pTrkB，4℃孵育过夜，滴加山羊抗兔IgG抗体37℃孵育2 h，在PVDF膜上滴加适量ECL发光液，放入曝光仪曝光显影，用Quantity One软件分析检测目的蛋白条带的灰度值，用目的条带灰度值除以相应β-肌动蛋白条带灰度值得到目的蛋白条带灰度值比值。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行数据分析。计量资料呈正态分布，以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的神经功能缺损评分比较 rTMS预处理组mNSS评分较模型组降低，rTMS预处理7次mNSS评分较rTMS预处理3次降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠的神经功能缺损评分(±s)

表1 各组大鼠的神经功能缺损评分(±s)

注：rTMS刺激组与模型组比较，aq=3.543，P=0.028，bq=3.729，P=0.017；rTMS预刺激7次组与rTMS预刺激3次组比较，cP=4.354，P=0.015。

对照组模型组rTMS预刺激3次组rTMS预刺激7次组F值P值10 10 10 10 0 9.87±1.23 7.42±1.76a 5.38±1.91bc 3.873 0.021

2.2 各组大鼠的伊文思蓝含量比较 模型组伊文思蓝含量较对照组升高，rTMS刺激组伊文思蓝含量较模型组降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠伊文思蓝含量比较(±s)

表2 各组大鼠伊文思蓝含量比较(±s)

555 9.383±1.093 29.829±8.633a 17.538±1.984b 5.993 0.018

2.3 各组大鼠BDNF和pTrkB免疫印迹表达水平比较 模型组BDNF和pTrkB蛋白表达较对照组减少，rTMS刺激组BDNF和pTrkB蛋白表达较模型组增多，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；rTMS预刺激7次组BDNF和pTrkB蛋白表达较rTMS预刺激3次组增多，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3和图1。

图1 各组大鼠脑源性神经营养因子、磷酸化酪氨酸激酶受体B免疫印迹法检测结果

表3 各组大鼠BDNF和pTrkB免疫印迹表达水平比较(±s)

表3 各组大鼠BDNF和pTrkB免疫印迹表达水平比较(±s)

注：对照组与模型组比较，aq=4.032，P=0.012，bq=3.583，P=0.028；模型组与 rTMS 预刺激 3次组比较，cq=3.153，P=0.047，dq=3.492，P=0.035；模型组与rTMS预刺激7次组比较，eq=4.089，P=0.014，fq=3.967，P=0.018；rTMS预刺激3次组与rTMS刺激预7次组比较，gq=4.127，P=0.027，hq=3.895，P=0.041。

组别对照组模型组rTMS预刺激3次组rTMS预刺激7次组F值P值pTrkB 28.834±2.197 4.211±0.078b 8.830±1.142d 16.876±1.873gh 4.289 0.026只数5555 BDNF 31.971±2.381 12.093±1.289a 16.683±1.492c 23.247±1.782ef 5.038 0.018

3 讨论

重复经颅磁刺激能对刺激局部和功能相关的远隔部位产生影响，由于其安全无创常用于临床方面的研究[12]。研究报道，rTMS对认知功能障碍[13]、重症抑郁[14]等神经精神疾病有肯定疗效，rTMS可促进缺血性脑卒中运动感觉障碍[15]、构音障碍[16]、单侧空间忽略[17]等功能的恢复。

近年来研究报道，rTMS预处理能诱导脑缺血耐受，LJUBISAVLJEVIC MILOS等[18]的研究表明，rTMS预处理可以通过调控相关基因表达，诱导合成具有神经保护作用的蛋白，从而促进大鼠缺血再灌注神经功能损伤的恢复。本研究发现，高频rTMS预处理可以降低脑缺血大鼠mNSS评分，改善缺血再灌注神经功能损伤，rTMS预刺激7次组效果更显著，表明高频rTMS预处理对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用可能有时间累积效应。

伊文思蓝常用于血脑屏障功能的检测，当血脑屏障受损时，伊文思蓝可以迅速与白蛋白结合并随之渗漏至脑组织中。研究发现，运动预处理[19]及药物[20-21]能改善血脑屏障的通透性。本实验中，rTMS刺激组伊文思蓝含量较模型组降低，推测高频rTMS预处理能改善脑缺血大鼠血脑屏障的通透性。血脑屏障破坏以及脑水肿，在急慢性脑缺血再灌注神经功能损伤中扮重要角色[22]。高频rTMS预处理改善血脑屏障通透性，可能是其改善缺血再灌注神经功能损伤的机制之一。

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通过多种机制发挥神经保护作用，如促进神经元的存活，抑制神经元及少突胶质细胞的凋亡，促进突触的生长和轴突再生等[23]。BDNF与特异性受体酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)结合，生成具有生物活性的磷酸化酪氨酸激酶受体B(pTrkB)，pTrkB可募集下游效应因子，诱导引起生长和分化的细胞内信号级联活化[24]。ZHAO等[25]的研究表明，人脐带间充质干细胞外泌体中的miR-206通过激活BDNF/TrkB/CREB信号通路，对蛛网膜下腔出血继发的早期脑损伤有神经保护作用。MITROSHINA等[26]发现，BDNF具有神经保护作用，能够减少原代培养海马神经元缺血性损伤引起的细胞凋亡。

本实验Western blotting结果表明，高频rTMS预处理能上调缺血再灌注大鼠脑组织BDNF和pTrkB蛋白表达，进而产生神经保护作用，改善脑缺血再灌注神经功能损伤。

综上所述，高频rTMS预处理可以改善全脑缺血再灌注大鼠神经功能损伤，其机制可能与其改善血脑屏障的通透性、诱导具有神经保护作用的蛋白表达增加相关。