FAT1在结直肠癌中的表达及临床意义

徐咏强，叶伟标，周婵，陈靖，李妤玲，何建芳

南方医科大学附属东莞市人民医院，广东东莞523000

结直肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，在欧美等西方发达国家恶性肿瘤疾病总发病率中位居第3[1]。现阶段，我国结直肠癌发病率逐年升高，主要与人们生活水平及饮食结构改变有关，尽管采取积极的综合治疗手段，中晚期结直肠癌特别是伴有复发或转移的患者5年生存率仍无显著的改善，所以应重视结直肠癌发生机理的研究，确定肿瘤转移及侵袭治疗靶点。脂肪非典型钙黏蛋白1（FAT1）是一种钙离子依赖的单向跨膜受体蛋白，其结合不同蛋白可参与一系列生物学行为，如细胞迁移、粘附及增殖等，且在维持肌动蛋白动力学、调控细胞极化和肿瘤转移等过程中发挥重要的作用。该研究选取2010年1月—2014年12月该院收治的85例患者为研究对象，旨在对结直肠癌中FAT1表达进行检测，分析FAT1与临床病理特征之间的关系，通过基因转染技术对FAT1基因的表达予以上调或抑制，观察FAT1对肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取南方医科大学附属东莞人民医院肿瘤外科收治的85例结直肠癌手术患者作为研究对象，均于入院，并收集所有患者的癌组织标本及配对的癌旁正常肠黏膜标本。纳入标准：①患者的临床病理资料完整；②术前均未行放化疗或靶向药物治疗；③术后经病理确诊为浸润性腺癌。纳入研究的患者中，男性49例，女性36例，年龄为46～82岁，平均为（62.5±9.6）岁。所有患者分期参考TNM分期系统。人肠癌细胞株SW620购自中国科学院上海细胞库。该研究经伦理委员会审核批准，患者及家属均知情同意。

1.2 方法

RT-PCR检测FAT1 mRNA的表达：通过显微切割选取具有代表性的区域，3张厚度为5μm的切片。总RNA的提取选取ReliaPrepTMFFPE Miniprep Systems。cDNA的逆转录合成选取RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit。PCR反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40个循环，72℃延伸5 min。EnVision法免疫组化染色检测FAT1蛋白的表达：选取二甲苯对切片进行脱蜡处理，梯度酒精水化，微波抗原修复，修复时间控制在2 min左右，于室温下置入3%H2O2内浸泡，浸泡时间控制在10 min左右，10%FBS室温封闭15 min后将小鼠抗人FAT1单克隆抗体(稀释度1：1 000)置入，于4℃环境下孵育过夜，复温之后将第二抗体置入，置入时间控制在30 min左右，经DAB显色与苏木素复染。参考相关学者[2]在相关研究中选用的方式，结合染色强弱（0代表阴性;1代表弱阳性;2代表中等阳性;3代表强阳性）与阳性细胞比例（0代表无;1代表＜10%;2代表10%～50%;3代表51%～80%；4代表＞80%）乘积对免疫反应进行评估。根据分值划分为不同程度表达，即低（1～3分）、中（4～8分）及高（9～12分）。Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力：构建Lv-FAT1-EGFP表达载体和psiLv-U6-FAT1 RNA干扰载体并转染，细胞转染时间达24 h之后，选取无血清培养基培制1×105/mL细胞悬液，然后于Transwell上室接种100μL细胞悬液，并将含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基500μL置入Transwell下室内。于37℃环境下培养24 h后，选取棉签将上室细胞擦除，4%多聚甲醛固定之后进行DAPI染色，于100倍镜下选取5个不同的视野，对迁移细胞平均数量进行测算。细胞侵袭实验开展过程中应预先选取Matrigel胶包被Transwell上室，其余步骤与细胞迁移实验相同。

1.3 统计方法

数据选取SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料用（±s）表示，两组间数据经t检验。计数资料用频数和百分比（%）表示，FAT1与病理参数相关性分析选取Mann-WhitneyU检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAT1表达及病理特征分析

RT-PCR发现，淋巴结转移癌组织、结直肠癌组织较正常肠黏膜组织FAT1 mRNA表达水平更高（P＜0.05）。免疫组化染色发现，细胞膜及细胞质中FAT1蛋白为高表达（见图1）。3种组织内FAT1蛋白均有表达，且表达强度呈递增趋势（见表1）。在纳入该研究的85例结直肠癌中，淋巴结转移与FAT1表达密切相关（P＜0.05），同肿瘤分化程度及部位与患者性别及年龄等无明显相关性（P＞0.05），见表2。

表1 FAT1在不同组织中的表达情况[n(%)]Table 1 FAT1 expression in different tissues[n(%)]

图1 FAT1在不同组织中的表达（×200）Figure 1 FAT1 expression in different tissues(×200)

表2 85例结直肠癌组织中FAT1表达与临床病理参数的关系（n）Table 2 Relationship between FAT1 expression and clinicopathological parameters in 85 cases of colorectal cancer（n）

2.2 FAT1对肠癌细胞株迁移和侵袭能力的影响

Transwell小室检测发现，FAT1过表达会增强SW620细胞株的侵袭能力，并促进其迁移（P＜0.05），见图2。

图2 SW620细胞株侵袭及转移中FAT1的影响图2 Figure 2 Effect of FAT1 on invasion and metastasis of SW620 cell line

3 讨论

结直肠癌是一种恶性肿瘤病症。据相关统计学资料显示,我国2015年结直肠癌发生率约为28.2/10万，病死率约为13.61/10万[3]。结直肠癌的发病率城市远高于农村，尤其是上海、江苏等东部沿海地区。现阶段，防治结直肠癌已成为我国医学研究热点。因早期阶段结直肠癌患者无明显症状及体征，多数患者确诊时已进展至中晚期，预后较差。FAT1属于钙黏蛋白超家族成员，最早由相关研究[4]在果蝇发育的研究中发现。FAT1基因定位于人类4号染色体长臂（4q35.2），分子结构及功能分析发现，FAT1胞内结构域能够Ena/VAPS、Scribble以及线粒体内膜相关蛋白等结合，发挥一系列生物学效应。目前，肿瘤发生、能量代谢及细胞生长调控等过程中FAT1发挥的作用受到了越来越多的关注。

目前研究发现，FAT1在胆管细胞癌、乳腺癌、口咽部鳞状细胞癌、弥漫性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病等多种恶性肿瘤中呈异常表达。相关学者[5]对22例胆管细胞癌进行免疫组化染色检测，发现FAT1在胞膜表达减弱与肿瘤的组织学分级和增殖指数显著相关，提示FAT1可能参与了胆管细胞癌的恶性演进。相关学者[6]在裸鼠体内成瘤实验中证实，利用转染shRNA下调PLC肝癌细胞株FAT1的表达，可促进肿瘤细胞凋亡，延迟成瘤时间。最近，有学者[7]通过体外细胞实验证实，靶向FAT1可通过LRP5/WNT2/GSS信号通路诱导氧化应激，并增强口腔鳞状细胞癌对顺铂的敏感性。该研究检测发现邻近正常肠黏膜组织中FAT1 mRNA和蛋白表达水平5.9%、0.0%，明显低于淋巴结转移癌组织34.3%、60.0%及结直肠癌组织36.5%、42.4%（P＜0.05），这与Piero等[8]的研究结果相一致，在其研究中，邻近正常肠黏膜组织中FAT1 mRNA和蛋白表达水平为5.7%、0.2%，低于淋巴结转移癌组织及结直肠癌组织。分析FAT1与患者临床病理参数的相关性，发现FAT1的表达水平与淋巴结转移相关（P＜0.05），提示FAT1可能与结直肠癌转移有关。此外，该研究利用体外细胞实验进一步证实，FAT1表达上调可增强肠癌细胞株侵袭能力，并促进其迁移。

综上所述，结直肠癌中FAT1呈高表达状态并与肿瘤侵袭及迁移有着密切关联，表明结肠癌发生及发展中FAT1可能发挥着十分重要的作用，有望成为治疗新靶点。FAT1在结直肠癌中的具体调控机制仍然有待深入研究。