2015-2017年广西东兴市活禽市场新城疫病毒流行状况调查

莫胜兰 张步娴 甘海霞 尹彦文 施开创 屈素洁 粟艳琼 邹联斌 韩银华

（广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，南宁530001）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一种RNA病毒，由其引起的鸡新城疫是我国鸡业最重要的疫病之一，该病发病急，致死率高，如防控不当会引起很大的经济损失[1，2]。东兴市地处中越边境，边境贸易频繁，活禽市场交易的家禽来源复杂，家禽和市场环境带毒情况不明，因此对活禽市场进行新城疫等重大动物疫病的监测，及时掌握新城疫疫情动态，可以有效提高广西边境地区家禽重大动物疫情的预测、预警、预报能力，进一步扎实推进基层动物疫病防控工作的开展，确保辖区内不发生新城疫疫情。为做好新城疫流行病学调查工作，以系统评估新城疫的流行状况及控制措施效果，本研究于2015-2017年对广西东兴市某活禽市场进行了系统监测，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 设备鸡胚自动孵化器由上海智诚公司生产；高速离心机由德国艾本德公司生产，自动化核酸提取仪由Tiangen公司生产；荧光定量PCR仪器由美国ABI公司生产，生物安全柜由美国BAKER公司生产。

1.1.2 试剂NDV阳性血清和抗原，新城疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，可从青岛立见科技有限公司购买;磁珠法DNA/RNA提取试剂盒可从北京Tiangen公司获得；SPF鸡胚（主要鸡传染病病原的鸡群）可从北京梅里亚公司购买。

1.1.3 样品采集2015-2017年对东兴市某活禽市场每年按季度进行样品采集，共采集到各种棉拭子样品1482份，其中鸡咽喉/肛门棉拭子样品540份，鸭咽喉/肛门棉拭子样品754份，环境（包含有饮水、笼具表面、地面粪便、排水沟污水）拭子188份，样品的详细信息见表1。采集的棉拭子保存在装有1mL保存液的2mL离心管中，在24h内若能及时检测的样品可以置于4℃冰箱短暂保存，否则样品应冷冻保存或运输。

保存液配方如下：将甘油200mL、0.01M PBS（pH值7.2）800mL和3g头 孢 西 丁 钠 混 匀 获 得1000mL样品保存液。

表1 东兴市某活禽市场2015-2017年新城疫病毒流行状况调查样品采集信息

1.2 病原分离和鉴定

1.2.1 病原分离将采集的棉拭子样品以10000 r/min离心5min，每份样品取上清液0.2mL，通过尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，放到鸡胚自动孵化器37℃孵育4d，观察频率为2次/d，丢弃1d内死亡的鸡胚，1d后死亡的鸡胚及时收集，至4d后将所有鸡胚置于冰箱冷藏层过夜，然后在生物安全柜中用注射器收集鸡胚尿囊液。

1.2.2 血凝试验根据国家标准《GB/T 16550-2008新城疫诊断技术》对收集的鸡胚尿囊液用血凝试验测定其血凝效价。

1.2.3 病毒鉴定病毒鉴定按照以下步骤进行：

第一步，待检样品总RNA提取：在核酸提取板的第一列和第七列分别加入200µL的上清液样品和20µL蛋白酶K，放到自动化核酸提取仪进行核酸提取。核酸自动提取按以下程序进行:移磁珠1min，吸磁60s→90℃裂解15 min，吸磁90s→85℃洗涤2min,吸磁90s→85℃洗涤,吸磁30s→85℃洗脱5min,吸磁90s→弃磁珠。结束程序后，将总RNA转移至干净的离心管中。

第二步，实时荧光RT-PCR检测:取出荧光RTPCR反应液、酶混合液，在室温融化后，瞬间离心，依照每份RT-PCR反应液17µL、酶混合液3µL的比例预混两种反应液到荧光专用反应管中；分别向加有反应液的PCR管中加入5µL样本RNA或阴性对照或阳性对照，混匀，将其放入荧光定量PCR仪器中，按以下步骤进行反应：第一阶段42℃5min，95℃10s；第二阶段95℃5s，60℃35s，共反应40个循环。在第二阶段的每个循环60℃退火过程中收集荧光。当样本的CT值小于35.0时，判断为阳性。

1.3 统计分析方法

用Excel软件对病毒阳性率分别按照样品采集时间和样品来源等进行分类统计和分析。

2 结果与分析

2.1 按时间分类的检测结果

对2015-2017年采集的1482份样品进行鸡胚接种收集尿囊液后用荧光RT-PCR方法对尿囊液进行检测，共检测到36份新城疫病毒阳性样品（见表2），样品的总阳性率为2.43%，2015年样本的阳性率最高达6.06%，2016年和2017年的阳性率相差不大，分别为0.74%和0.83%，远远低于2015年的阳性率。

表2 东兴市某活禽市场NDV检测结果（按年份）

表3 东兴市某活禽市场NDV检测结果（按样品来源）

2.2 按样品来源分类的检测结果

从不同来源的样品中均能分离到新城疫病毒，鸡、鸭和环境样品在2015年的阳性率均为最高，2016年和2017年阳性率差别不大。其中环境样品的阳性率最高，总阳性率达5.85%，而在2015年的阳性率高达18.97%，2016年和2017年却未分离到病毒；鸡拭子的总阳性率为2.78%，2015年的阳性率为5.88%，2016年和2017年的阳性率分别为1.25%和1.43%；鸭拭子的阳性率最低，总阳性率仅为1.33%，2015年的阳性率2.99%，2016年和2017年的阳性率分别为0.67%和0.45%，见表3。表明新城疫病毒在东兴某活禽市场的环境和家禽中均有存在，家禽样品的阳性率与环境样品阳性率密切相关，环境的带毒率越高，家禽的阳性率就越高。

3 讨论

本研究对东兴某活禽市场新城疫病毒流行状况进行了持续3年的监测，结果显示，该市场上采集的样本新城疫病毒总体阳性率为2.43%，这个结果与段博芳等在云南的监测结果基本符合[3]。新城疫病毒在东兴某活禽市场的分布与样品来源密切相关，其中鸡的感染率高于鸭子[4]，环境中带毒量最高。从不同年份监测的结果看，2015年该市场的新城疫病毒阳性率最高，而2016年和2017年的阳性率则大幅降低，可能的原因是2016年和2017年由于受H7N9的影响，该市场管理单位加强了对市场的清洗和消毒，新城疫病毒存活的环境被破坏了，使得环境中的新城疫病毒的带毒量显著降低，从而降低了家禽感染新城疫的风险。

近年来，随着我国全面清除新城疫的防治战略的深入，以及养鸡业的不断发展，新城疫的高发病势头得到了一定程度的控制，总体呈下降趋势[5]。我国家禽新城疫流行逐年减少的原因可能与我国目前新城疫的综合防控措施有关。首先，疫苗接种在新城疫的预防和控制中起着重要作用。家禽从业人员普遍认识到新城疫对家禽养殖业的危害很大，实施免疫的积极性和主动性较好。其次，近年来新城疫疫苗质量不断提高，新城疫疫苗配送所需的基层冷链体系效果显著，新城疫预防工作更加扎实。最后，目前我国家禽养殖方式由农户散养向规模养殖转变，生物安全管理水平越来越高，降低了新城疫发生风险。本研究较为系统和科学地对广西东兴市某活禽市场新城疫病毒流行状况进行了持续监测，揭示了新城疫病毒在活禽市场的环境中和家禽中在不同年份分布的一些规律，可为预防和控制NDV提供一些重要的流行病学信息。