传统藏式牦牛酸奶中优良乳酸菌筛选与产香性能分析

梁明明,曹菲薇,杨欢东,于 靓,郑志瑶,梁竟一,王伟军,陈 波,刘建新,任大喜,*

(1.浙江大学动物科学学院,奶业科学研究所,浙江杭州 310058;2.浙江一鸣食品股份有限公司,浙江温州 325000)

乳酸菌是一类具有多种益生功能的微生物,因其良好的发酵特性,目前广泛应用于发酵食品中[1]。乳酸菌在发酵过程中会产生一系列的酶,分解乳中的糖、蛋白质和脂肪等物质,生成可挥发性化合物来影响或改变产品的香气。酸奶中的香味物质有多种,其中双乙酰是酸奶最重要的特征风味物质之一,具有奶油香味,常被用于评价酸奶香气品质[2-4]。乙醛是另一种重要的风味物质,产品中乙醛能赋予酸奶青苹果和坚果的风味[5]。此外,2-丙酮和2-丁酮也是衡量酸奶品质的两种重要化合物,能赋予酸奶特殊的甜香和果香味。

西藏、川西等高原牧区牦牛奶资源丰富,当地牧民世代沿用传统而古老的自然发酵方法制作的藏式酸奶组织细腻、风味独特[6]。当地牦牛发酵乳中蕴含有遗传稳定性好、抗逆性强、性能优良的乳酸菌[7-10]。国内部分研究学者对我国不同地区的传统发酵乳制品进行了筛选工作[11-13],邵建宁等[14]从甘南牧区、河西牧区采集的传统发酵乳制品中分离筛选出96株乳酸菌,经发酵性能评价最终筛选出6株优良乳酸菌。秦虹等[9]从甘肃部分藏区采集的自然发酵牦牛乳中分离出195株乳酸菌,经过发酵性能和产香能力评估,最终选出5株性能优良的乳酸菌。张和平[15]从中国西部及蒙古国的951份自然发酵乳制品中分离鉴定出3388株乳酸菌,建立中国首个原创性乳酸菌菌种资源,并从中筛选出一株性能优良的乳酸菌(L.caseiZhang)，且已将其投入到了产业化生产中。

虽然国内学者在乳酸菌的筛选等方面已有研究,但目前可以投入商业化应用的乳酸菌仍然较少。因此,本研究旨在从藏式传统牦牛酸乳中分离鉴定乳酸菌,并结合发酵性能和产香性能等进行筛选,期望从中筛选到性能优良的菌株用于工业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛酸乳 采自于四川阿坝藏族羌族自治州阿坝县、红原县、诺尔盖县等地的游牧牧民家中,传统手工发酵,共计26份;嗜热链球菌903(发酵剂) 分离自科汉森公司;4-甲基-2-戊酮 色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司;无抗脱脂奶粉 新西兰恒天然有限公司;MRS培养基、M17培养基 北京陆桥技术股份有限公司;生牛乳 浙江一鸣股份食品有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒 生工生物工程(上海)有限公司。

ECLIPSE E100光学显微镜 日本Nikon公司;FE28数显pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;固相微萃取头DVB/CAR/PDMS(50/30 μm) 美国Sigma-Supelco公司;7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦有限公司;DW-HW258超低温冰箱 中科美菱低温科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的分离纯化 取10 mL样品于90 mL生理盐水中进行梯度稀释,取0.1 mL合适稀释度的样品稀释液,涂布于MRS(用于分离杆菌)或M17(用于分离球菌)固体培养基上,置于37 ℃培养48 h。观察菌落生长情况,挑取具有乳酸菌典型特征的单个菌落,在分离培养基上反复划线培养直至电子显微镜镜检为纯菌株。进行革兰氏染色和H2O2酶实验,选择革兰氏阳性、H2O2酶阴性的菌株,接种于MRS、M17液体培养基中,在37 ℃培养18 h后,置于40%(V/V)的甘油管中-80 ℃冷冻保藏。科汉森商业发酵剂中的菌株也采用上述M17培养基进行分离,经过纯化和镜检后作为本研究的对照菌株(903)。

1.2.2 菌株的初筛

1.2.2.1 遗传稳定性分析 将经过16S rDNA鉴定后确认为基础乳酸菌的菌株活化,按接种量2%(V/V)比例接种到10 mL 12%(w/V)的灭菌脱脂乳中,在37 ℃条件下发酵,以肉眼观察脱脂乳培养基变黏稠,呈凝胶状,试管倒置不呈流动液体时,则视为可以凝乳。置于4 ℃冷藏24 h,记录凝乳时间,观察色泽、组织状态、乳清析出等。如此连续传代20次,选择连续传代可以凝乳且状态稳定的菌株进行下一步筛选。

1.2.2.2 滴定酸度测定 根据GB/T 5009.239-2016 《食品酸度的测定》[16]的方法进行滴定酸度测定,以重复性条件下获得的三次独立测定结果的算术平均值表示。

1.2.2.3 凝乳时间测定 将遗传表现稳定的菌株以接种量2%(V/V)比例接种到250 mL 12%(w/V)灭菌脱脂乳中,在37 ℃条件下培养。按1.2.2.2滴定酸度的测定方法进行酸度测定,根据GB/T 19302-2010《发酵乳》[17]中对酸乳酸度的要求,以酸度>70 °T为发酵终点,测定发酵时间。

1.2.2.4 感官评价 根据国标GB 19302-2010《发酵乳》[17]中对发酵乳的感官要求进行感官评价,按表1进行评价分数计算。由10位食品相关的专业人员分别对冷藏24 h后的发酵乳进行感官评价,包括:色泽评定:将适量酸乳放入烧杯中,在日光灯下观察其色泽；滋味和气味评定:打开封盖后马上闻气味,然后用温水漱口,再品尝滋味；组织状态评定:将酸乳倾斜倒在光滑的黑瓷板上,略微倾斜转动,仔细观察组织状态。感官评价总分100分,其中色泽10分,滋味和气味40分,组织状态50分。

表1 发酵乳感官评价标准Table 1 Standards for sensory evaluation of fermented milk

1.2.3 菌株的鉴定 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取乳酸菌的总基因组,以其为模板进行PCR扩增。采用细菌通用PCR扩增引物:正向引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′);反向引物1541r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。PCR扩增条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,如此进行30次循环;72 ℃延伸10 min后,PCR仪降至12 ℃进入保温程序。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶检验合格后送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。将所得的序列在NCBI数据库中通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行同源性比较分析,下载与目标菌株序列同源性相近的菌株序列,利用MEGA-X 软件NJ(neighbor joining)方法构建系统发育树(自展数:1000),以鉴定每个菌株的种类。

1.2.4 菌株产香能力分析 样品制备:将筛选到的菌株,按2%(V/V)比例接种到灭菌生牛乳中。置于37 ℃条件下进行发酵,凝乳后的酸奶置于4 ℃冰箱,后熟24 h后用于风味分析。分析采用固相微萃取顶空法与气相色谱-质谱联用技术(SPME-GC-MS)按照文献[18]方法测定样品中的挥发性风味物质,以此衡量菌株代谢产香的能力。

样品的前处理:取约100 g酸奶样品于250 mL固相微萃取瓶内,加入50 mL超纯水,同时加入100 μL内标溶液(4-甲基-2-戊酮,50 mg/kg)。样品置于55 ℃水浴中磁力搅拌平衡30 min,采用固相微萃取吸附45 min后进样。

气相色谱条件:色谱柱采用为DB-WAX柱(柱长60 m,内径0.25 mm,液膜厚度0.5 μm)。采用程序升温条件,起始柱温为35 ℃,并保持1 min,然后以3 ℃/min升温至220 ℃,保持10 min,20 ℃/min升温至240 ℃,保持5 min。载气为高纯He(99.999%),流速1.0 mL/min,采用不分流操作。质谱条件:电离方式EI,电子能量为70 eV,接口温度、四级杆温度、离子源温度分别为240、150、230 ℃。扫描质量范围为m/z 33～500。

未知化合物经计算机与质谱图库相匹配,报告选择匹配度大于80%的鉴定结果。风味物质的定量分析由内标法确定(内标为4-甲基-2-戊酮),即采用各成分峰面积与内标物峰面积对比进行半定量分析,计算公式如下,

挥发性物质浓度(μg/L)=(各成分峰面积×内标物质量)/(内标物峰面积×样品量)

1.3 数据统计

所有试验重复3次及以上,文中数据采用均值和标准偏差表示,采用SPSS软件进行统计分析。采用单因素方差分析进行比较,依据Turkey进行显著性分析,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株初步筛选结果

26份酸奶样品中共分离纯化得到114株纯菌株,遗传稳定性测定筛选出36株可以凝乳且凝乳状态稳定的乳酸菌用于后续发酵性能筛选。

将上述遗传稳定的基础菌株在发酵乳中培养,通过测定其发酵时间及感官评价,初步筛选出5株乳酸菌(AB0101、AB0801、AB1504、AB2302、AB2402),结果如表2所示,5株单菌株在37 ℃下发酵12%(w/V)的脱脂乳时,凝乳时间为4.5～7.5 h,发酵终点的滴定酸度为74.0～78.4 °T,符合国标对发酵乳产品要求(>70 °T)[17];各菌株感官表现良好,评分在79.6～86.3之间。其中菌株AB0101的凝乳时间与滴定酸度,AB1504的滴定酸度和感官评价均与商业菌株903无显著差异,表现优良。与本研究结果类似,邵建宁等[14]从甘肃牧区采集的传统发酵乳制品中分离筛选出6株发酵性能优良的乳酸菌,在37 ℃下发酵牛乳,凝乳时间在6.5 h以内,发酵乳酸度>70 °T,组织状态较好,凝乳完整。由此可见,本试验筛选的五株乳酸菌遗传稳定、发酵时间短、感官评分高,发酵性能优良,可用于后续研究。

表2 5株乳酸菌初筛试验结果Table 2 Results of primary screening of 5 LAB strains

2.2 分子生物学鉴定结果

五株初筛菌株的菌落形态、细菌形态和16S rDNA的PCR扩增片段电泳图等见图1和图2。系统发育树分析图如图3所示。可知,菌株AB0101、AB0801、AB2402的菌落形状不规则,边缘啮齿状,表面光滑,有光泽,易挑起,革兰氏染色均为阳性,符合乳杆菌的形态学特征。16S rDNA的测序结果显示与德氏乳杆菌保加利亚亚种(Sequence ID:HM058208.1)的相似度最高,相似度均>99%,判断为德氏乳杆菌保加利亚亚种。其中AB0101、AB0801菌落扁平,且呈半透明或透明状;而AB2402菌落隆起,乳白色,不透明,革兰氏染色均为阳性,符合乳球菌的形态学特征。16S rDNA的测序结果显示AB1504和AB2302与嗜热链球菌(Sequence ID:EF990662.1、Sequence ID:MN447108.1)的相似度最高,相似度均为100%,因此判断菌株AB1504、AB2302均为嗜热链球菌。

图1 5株菌的菌落形态和显微镜图Fig.1 Colony diagram and microscopic diagram of 5 strains

图2 菌株16S rDNA的PCR扩增片段电泳图Fig.2 PCR fragment of 16S rDNA of strain注:电泳图从左到右分别是M:Marker;A:AB0101;B:AB0801;C:AB2402;D:AB1504;E:AB2302。

图3 5株乳酸菌的系统发育树分析Fig.3 Phylogenetic tree of 5 LAB strains注:采用邻接(Neighbor-Joining)法和 p距离公式进行系统发育分析,括号内为GenBank收录号, 每个分支点处的数字为Bootstrap(l000次抽样)的支持百分率,标尺代表0.1%的序列差异度。

2.3 菌株产香能力分析

本研究采用固相微萃取-顶空气相色谱质谱联用方法对初筛得到的5株乳酸菌进行发酵乳的香味物质进行分析,菌株AB1504发酵乳色谱图如图4所示。共检测出40多种挥发性物质,主要有有机酸类、醛类、酮类、醇类、酯类、芳香烃和含硫化合物等组分,五株单菌株发酵乳与商业菌剂903发酵乳的风味物质含量结果如表4所示。

表3 菌株发酵乳中的风味物质浓度(mg/L)Table 3 Aroma compounds in fermented cow milk produced by pure cultures(mg/L)

图4 菌株AB1504发酵乳的色谱图 Fig.4 Chromatogram of fermented milk of strain AB1504

目前认为酸奶中重要的香味物质主要包括乙醛、双乙酰、乙偶姻、丙酮及丁酮等香味物质。五株菌株发酵乳与商业菌剂发酵乳中,只有菌株AB1504和商业菌剂903的发酵乳中检测出双乙酰,含量分别为4.90、2.90 mg/L。田怀香等[19]从西藏灵菇中筛选高产双乙酰的乳酸菌,产双乙酰的能力为11.13 mg/L,彭涛等[25]从新疆的自制酸奶筛选到一株高产双乙酰的戊糖乳杆菌。本研究中菌株AB1504与商业菌剂903中也均有较高的乙偶姻。乙偶姻与双乙酰相似,但乙偶姻的风味明显弱于双乙酰,双乙酰乙酰基通过还原酶可以转化为乙偶姻,这有助于减弱酸奶中的刺激风味[20]。乙醛也是酸奶中重要的风味物质,酸奶中乙醛主要由苏氨酸代谢产生[21],能够赋予酸奶新鲜的青苹果或坚果风味[5]。商业菌剂903发酵乳检测出的乙醛含量最高(1.7 mg/L),其次是菌株AB1504发酵乳(1.13 mg/L),其他菌株发酵乳含量较低。丙酮和丁酮也是衡量酸奶制品风味的两种重要化合物。丙酮具有甜香和果香,可赋予酸奶特殊风味,酸奶中的丙酮一部分来自牛乳本身,另外一部分则由乳酸菌发酵产生[22]。根据前人的研究报道典型酸奶中丙酮的浓度为0.3～4.0 mg/L[23],本试验中,五株单菌株发酵乳中检测到的丙酮含量均在此范围内,而商业菌剂903的发酵乳中丙酮含量为4.35 mg/L。丁酮也可赋予酸奶特殊的香味,通常酸奶中丁酮的含量要低于丙酮,本试验中检测到的丁酮含量均低于丙酮。此外,发酵产生的酸类中乙酸也有一定的香味[24],研究表明乙酸在酸奶中含量在0.5～18.8 mg/L 时最佳[19],酸奶中乙酸含量过高则会产生醋味,不容易被消费者接受[5]。本研究中五株菌株产生的乙酸含量浓度均在1 mg/L左右,商业菌剂903发酵乳中乙酸含量较高(14.3 mg/L)。本研究酸奶的风味物质还包括醇类、酯类和硫化物等,菌株不同含量也有各有差异。综上所述,嗜热链球菌AB1504发酵乳产生香味成分含量丰富,双乙酰、乙醛、乙偶姻、丙酮及丁酮等酸奶关键香味物质浓度接近或高于商业菌株,具有商业开发应用的潜力。

3 结论

从四川阿坝藏区羌族自治州地区采集的26份传统藏式牦牛酸奶中分离到114株菌株。经遗传稳定性、凝乳时间及感官评价等初筛方法筛选出5株发酵性能较优良的菌株,其凝乳时间为4.5～7.5 h;滴定酸度为74.0～78.4 °T,感官评分为79.6～86.3。其中菌株AB0101和AB1504在发酵性能上与商业菌株接近。通过顶空气质测定发酵乳的风味物质,发现菌株AB1504发酵产生的乙醛、双乙酰等关键风味物质的含量显著高于其他菌株,且接近于商业发酵剂,经鉴定菌株AB1504为嗜热链球菌。上述研究结果表明嗜热链球菌AB1504具有良好的发酵性能和产香能力,具有商业应用的潜力。