虎奶菇MnSOD提取、鉴定及基因的克隆

杨加亮,田云恒,马爱民

(华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070)

虎奶菇(Pleurotustuber-regium(Fr.)Sing)属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属,又称菌核侧耳,是热带地区一种珍贵的食药真菌[1],主要分布在我国云南省以及缅甸和非洲的尼日利亚等地[2]。虎奶菇营养价值丰富,含有真菌多糖、矿物质及生物活性酶等多种具有抗氧化功能的活性成分[3]。虎奶菇抗氧化方面的研究主要集中在对虎奶菇多糖的研究[4-6],对于同样具有抗氧化作用的生物活性酶的研究不多。

本研究提取了虎奶菇Mn-SOD,通过酶活测定和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳活性染色等方法鉴定虎奶菇Mn-SOD。通过同源克隆、cDNA末端快速扩增技术和融合引物与巢式PCR等方法从虎奶菇中克隆获得一个虎奶菇Mn-SOD基因,利用在线工具进行生物信息学分析,同时采用邻接法构建系统进化树,从基因及其编码的蛋白来研究虎奶菇Mn-SOD的理化性质和结构特点。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虎奶菇菌株(Pleurotustuber-regium(Fr.)Sing) 华中农业大学食品微生物实验室提供,32 ℃保存于PDA斜面培养基上;大肠杆菌感受态DH5α北京全式金生物技术有限公司;pMD18-T质粒、DNA ligation kit ver. 2.1、RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit、M-MLV RTase cDNA synthesis kit TaKaRa公司;E.Z. N.ATMCycle-pure Kit、Gel Extraction Kit、Plasmid DNA Mini Kit I Omega公司;氨苄青霉素 Sigma-Aldrich;Trans2K Plus DNA Marker、Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker、Taq DNA polymerase 北京全式金生物技术有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 武汉谷歌生物科技有限公司;核黄素、氮蓝四唑(NBT) Sigma-Aldrich;CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒(WST-8法) 碧云天生物技术公司;引物的合成和序列的测定 武汉天一辉远有限公司。

梯度PCR仪 BioRad;DYY-8C型电泳仪、DYCP-31DN型水平电泳槽 北京六一仪器厂;Centrifuge 5415R冷冻高速离心机 德国Eppendorf公司;热电FC酶标仪 美国Thermo scientific公司;STUART SA8漩涡振荡混合器 vedgen;GEL LOGICAL 200凝胶成像系统 美国Kodak公司;VCX500超声破碎仪 美国Sonics公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虎奶菇Mn-SOD的提取及鉴定

1.2.1.1 虎奶菇Mn-SOD的提取 方法参照高建华等[19]方法,取3 g虎奶菇菌丝用液氮研磨,按每1 g虎奶菇菌丝加入4 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L,pH7.8,含0.1 mmol/L EDTA),放在振荡器上洗涤30 min,4000 r/min离心20 min,收集上清液与沉淀,上清液备用,沉淀为菌丝体;每克沉淀加入1 mL磷酸盐缓冲液悬浮,100 W超声波破壁5 min,静置提取30 min,4000 r/min离心20 min,收集上清液,与原上清液混合,此即SOD粗提液。粗提液加硫酸铵至30%饱和度,冰浴、搅拌2 h后,4 ℃、10000 r/min离心10 min。取上清液并再加硫酸铵至85%饱和度,冰浴、搅拌2 h后,4 ℃、10000 r/min离心10 min,收集沉淀,计算回收率,公式如下:

式中:m表示虎奶菇菌丝加入量,g;m1表示处理回收得到的沉淀,g。

沉淀用少量的磷酸缓冲液溶解,即得盐析液。将盐析液放入透析袋用磷酸缓冲液透析过夜。每隔1 h换一次缓冲液,透析过程中充分搅拌,即得透析液。

1.2.1.2 虎奶菇Mn-SOD的酶活力测定 用WST-8法测定虎奶菇Mn-SOD的酶活力。按照碧云天公司CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒(WST-8法)[20]推荐步骤处理。在37 ℃环境中反应30 min,测定在波长450 nm下的吸光值。由空白对照组和样品的吸光值可计算出抑制百分率,公式如下:

当抑制百分率为50%时,反应体系中的SOD酶活力定义为1个酶活力单位(U)。根据抑制百分率可计算出酶活力单位,公式如下:

1.2.1.3 虎奶菇Mn-SOD的鉴定 采用抑制剂敏感性实验鉴定酶的种类。所采用的抑制剂为H2O2。取两份透析液,一份加入H2O2溶液;一份不加入H2O2溶液。混匀后取相同体积样品进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,参照Yin等[21]方法。凝胶采用12%分离胶和5%浓缩胶。样品进行非变性电泳后,凝胶取出洗净,放入25 mL NBT(2.45 mmol/L)溶液中浸泡45 min,简单洗后在黑暗环境中再放入30 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L、pH=7.8、含28 mmol/L四甲基乙二胺(TEMED)和0.028 mmol/L核黄素)中浸泡30 min。染色完成后,胶放入磷酸缓冲液(50 mmol/L、pH=7.8、含0.1 mmol/L EDTA)中,4×8 W日光灯下光照30 min,直至背景上有清晰透明的SOD活性谱带。

1.2.2 虎奶菇Mn-SOD基因的克隆

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.2.2.1 基因组DNA的提取 虎奶菇基因组的提取采用改进的CTAB法[22],将培养的虎奶菇菌丝体用液氮研磨成粉末,取20 mg左右至1.5 mL离心管中;取700 μL Extraction Buffer至离心管,70 ℃水浴30 min,每10 min颠倒一次;加等体积PCA,混匀,12000 r/min,室温离心15 min;上清转管,加等体积-20 ℃预冷的异丙醇,混匀,室温沉淀10 min,12000 r/min,4 ℃离心10 min,弃上清;加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀,12000 r/min,4 ℃离心3 min,室温干燥;加入 20 μL 1×TE Buffer溶解DNA,样品于-20 ℃保存备用。

1.2.2.2 总RNA的提取和cDNA第一条链的合成 虎奶菇菌丝总RNA的提取采用Trizol法,以提取的总RNA为模板采用PrimeScriptTMRT reagent Kit 反转录成cDNA,操作参照试剂盒说明书,合成的cDNA用于基因克隆。采用M-MLV RTase cDNA synthesis kit,使用锚定引物AP(表1)将RNA转录成cDNA,命名为cDNA 1,合成的cDNA 1用于克隆虎奶菇Mn-SOD基因3′端cDNA片段。RNA和cDNA样品保存于-80 ℃备用。

1.2.2.3 虎奶菇Mn-SOD基因cDNA保守片段的克隆 根据NCBI和JGI数据库中糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)、晶粒鬼伞(Coprinellusmicaceus)、茯苓(Wolfiporiacocos)、灰光柄菇(Pluteuscervinus)和香菇(Lentinulaedodes)等担子菌的Mn-SOD氨基酸序列,分析保守区域,设计简并引物MnSod1-F和MnSod1-R(表1)扩增Mn-SOD基因cDNA保守片段。以cDNA为模板进行PCR扩增,条件如下:预变性94 ℃,5 min;变性94 ℃,1 min;退火54 ℃,30 s;延伸72 ℃,1 min;循环数30;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取50 μL PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳,切下与目的条带位置大小接近的条带,用E.Z.N.ATMGel Extraction kit 胶回收试剂盒的方法进行回收。回收片段与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄青霉素(100 μg/mL)抗性筛选及菌落PCR验证后,选择阳性克隆,送武汉天一辉远公司进行测序,获得虎奶菇Mn-SOD基因的保守片段cDNA序列。

1.2.2.4 虎奶菇Mn-SOD基因3′端cDNA片段的克隆 用RACE技术(Rapid amplification of cDNA end,cDNA末端快速扩增技术)克隆虎奶菇Mn-SOD基因3′端cDNA片段。根据1.2.2.3中获得的虎奶菇Mn-SOD基因保守区域cDNA序列,设计3′RACE引物SOD-RF与合成的引物AUAP(表1),以1.2.2.2中cDNA 1为模板,进行PCR扩增,条件如下:预变性94 ℃,5 min;变性94 ℃,1 min;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,1 min;循环数30;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR产物进行同1.2.2.3处理,挑选阳性克隆,进行测序。拼接3′端cDNA序列与保守片段cDNA序列,得到包含保守片段的3′端cDNA片段。

1.2.2.5 虎奶菇Mn-SOD基因5′端DNA片段的克隆 利用FPNI-PCR(Fusion primer and nested integrated PCR,融合引物与巢式PCR)技术克隆虎奶菇锰超氧化物歧化酶基因5′端DNA片段。根据1.2.2.4中包含保守片段的3′端cDNA片段,设计引物SODF和SOD-R(表1),以DNA为模板,扩增出虎奶菇Mn-SOD基因3′端DNA片段,测序得到DNA序列。按照FPNI-PCR引物设计要求,设计三个由近及远的下游特异引物SP1、SP2和SP3(表1)。以虎奶菇DNA为模板,以SP3、SP2、SP1分别与合成的FP2、FSP1、FSP2(表1)组成引物对,进行三轮PCR[23]。第二轮和第三轮PCR产物进行同1.2.2.3处理,挑选阳性克隆,进行测序,获得虎奶菇Mn-SOD基因5′端DNA序列。

1.2.2.6 虎奶菇Mn-SOD基因的克隆 将1.2.2.5中获得的虎奶菇Mn-SOD基因5′端DNA序列和3′端DNA序列通过软件DNAMAN 6.0进行拼接,剔除重叠部分。把拼接结果通过NCBI数据库进行BLASTx比对,设计引物SOD-F(表1)与SOD-R分别以DNA和cDNA为模板扩增虎奶菇Mn-SOD基因全长的DNA和cDNA片段,PCR扩增,条件如下:预变性94 ℃,5 min;变性94 ℃,1 min;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,1 min;循环数30;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR产物进行同1.2.2.3处理,挑选阳性克隆,进行测序,获得虎奶菇Mn-SOD基因的DNA和cDNA序列。

1.2.3 虎奶菇Mn-SOD基因的生物信息学分析

1.2.3.1 虎奶菇Mn-SOD基因序列的生物信息学分析 用NCBI数据库中BLASTx(https://blast. ncbi. nlm. nih.gov/Blast.cgi)进行基因序列比对;利用软件Editseq对拼接结果进行分析,寻找开放阅读框(ORF);用软件DNAMAN 6.0对得到的基因DNA序列和cDNA序列进行比对,预测内含子情况,并将cDNA序列翻译成氨基酸序列,便于对编码的蛋白进行分析。

图2 PtMn-SOD基因的克隆Fig.2 Cloning of PtMn-SOD gene注:M:Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker;M1:Trans2K Plus DNA Marker;A:虎奶菇菌丝体DNA提取电泳检测结果,其中泳道1是虎奶菇菌丝体DNA;B:虎奶菇菌丝RNA提取电泳检测结果,其中泳道1是虎奶菇菌丝体RNA;C:PtMn-SOD基因保守区域cDNA片段PCR结果,其中泳道1是保守区域cDNA片段扩增产物;D:PtMn-SOD基因3′RACE PCR结果,其中泳道1是3′端cDNA片段扩增产物;E:PtMn-SOD基因3′端片段PCR结果,其中泳道1是3′端DNA片段扩增产物;F:PtMn-SOD基因5′端FPNI-PCR结果,其中泳道1是FPNI-PCR第二轮扩增产物,泳道2是FPNI-PCR第三轮扩增产物;G:PtMn-SOD基因全长DNA和cDNA PCR结果,其中泳道1是DNA扩增产物,泳道2是cDNA扩增产物。

1.2.3.2 虎奶菇Mn-SOD基因编码蛋白的生物信息学分析 用在线ProtParam tool(http://web. expasy. org/protparam/)分析氨基酸基本理化性质;利用在线Prosite(https://prosite.expasy.org/scanprosite/)分析蛋白的功能位点;利用在线Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对不同物种间Mn-SOD蛋白进行多序列比对;利用软件MEGA 5.1,采用邻接法构建系统进化树;用在线软件DAS-TMfilter(http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/DAS.html)进行跨膜结构预测;用SignaIP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)分析蛋白的信号肽情况;用软件PSORT(http://psort.nibb.ac.jp/)进行亚细胞定位;利用在线分析工具SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)预测蛋白的二级结构;借助Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/interactive)对Mn-SOD蛋白进行三维结构预测并构建3D模型。

2 结果与分析

2.1 虎奶菇 Mn-SOD 提取及鉴定

2.1.1 虎奶菇Mn-SOD提取 将3 g虎奶菇菌丝体,经研磨、超声、硫酸铵沉淀,收集到沉淀0.45 g。回收率为15%。透析处理之后,得到酶液。

2.1.2 虎奶菇Mn-SOD酶活的测定 用WST-8法测定Mn-SOD酶活,结果表明酶液能有效抑制甲臜染料的生成,表现出明显的抗氧化活性。抑制百分率分别为62.3%,计算出虎奶菇Mn-SOD酶活力为1.66个酶活力单位。

2.1.3 虎奶菇Mn-SOD的鉴定 由于Mn-SOD对H2O2具有一定的抗性[16],因此可以用H2O2鉴定虎奶菇SOD的类型,非变性PAGE胶活性染色结果如图1所示。由图1可知,酶经过H2O2处理后仍然有一定的活性,与未处理无明显差异,表明虎奶菇中SOD主要是Mn-SOD。

图1 虎奶菇Mn-SOD鉴定Fig.1 Identification of Mn-SOD from P. tuber-regium注:1:未添加H2O2的透析液;2:添加H2O2的透析液。

2.2 虎奶菇Mn-SOD基因的克隆

图2(A、B)分别是提取的DNA和RNA电泳检测图。利用简并引物MnSod1-F和MnSod1-R扩增获得了373 bp的保守区域cDNA片段(图2C)。3′RACE反应获得了约339 bp的3′端cDNA序列(图2D),与保守序列拼接,得到含有564 bp的3′端cDNA序列。使用引物SODF和SOD-R扩增,得到含有792 bp的3′端DNA序列(图2E)。FPNI-PCR反应获得了约1900 bp的5′端DNA序列(图2F)。将5′端和3′端序列进行拼接。用引物SOD-F与SOD-R扩增虎奶菇Mn-SOD基因的DNA及cDNA(图2G),测序结果与相应拼接序列完全一致,命名该基因为PtMn-SOD。

图4 基因PtMn-SOD内含子序列结构图Fig.4 The intron positions in the PtMn-SOD gene

2.3 虎奶菇Mn-SOD基因的生物信息学分析

2.3.1 虎奶菇Mn-SOD基因序列的生物信息学分析 经过NCBI数据库中BLASTx比对,发现与糙皮侧耳(登录号:MH645359.1)的Mn-SOD基因序列同源性达到79%,初步确认已成功获得虎奶菇Mn-SOD基因。使用软件Editseq对序列起始密码子、终止密码子的位置进行预测。虎奶菇PtMn-SOD基因的DNA序列全长1025 bp和cDNA序列全长747 bp。其中开放阅读框(ORF)长为663 bp,编码220个氨基酸(图3)。

图3 基因PtMn-SOD的cDNA序列及推导的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and amino acid sequence of PtMn-SOD gene注:阴影部分为Mn-SOD蛋白的保守区域。

使用DNAMAN 6.0软件对得到的PtMn-SOD基因DNA序列和cDNA序列进行分析,发现PtMn-SOD具有7个内含子(图4),这七个内含子的序列长度分别为50、50、51、52、54、54和51 bp。第一、第二和第五个内含子的剪切规则为TA-GG,第三个内含子的剪切规则为TG-GG,第四、第六和第七个内含子的剪切规则为GT-AG。

2.3.2 虎奶菇Mn-SOD基因编码蛋白的生物信息学分析 经ProtParam软件分析可知PtMn-SOD基因所编码蛋白质的分子式是C1112H1706N300O323S3,分子量为24.54 kDa,理论等电点为7.86,属于碱性蛋白。负电荷残基(Asp+Glu)数为22个,正电荷残基(Arg+Lys)数为 23个。不稳定系数为34.09,属于稳定蛋白质;脂肪系数为81.68。总平均亲水性为-0.366,预测该蛋白是亲水性蛋白。

对蛋白质进行功能位点分析,发现在第181～188位氨基酸之间有Mn-SOD蛋白特征位点,即DIWEHAFY。把Mn-SOD蛋白氨基酸序列与茯苓、晶粒鬼伞、香菇、草菇、糙皮侧耳、奥氏蜜环菌(Armillariasolidipes)、高卢蜜环菌(Armillariagallica)、乳白蛋巢菌(Crucibulumlaeve)和灰光柄菇等九种真菌的Mn-SOD蛋白进行多序列比对,发现PtMn-SOD蛋白与九种真菌的Mn-SOD蛋白具有高度的相似性(75%以上)(图5),进一步证明已成功获得虎奶菇Mn-SOD基因PtMn-SOD。

图5 PtMn-SOD蛋白与其他真菌Mn-SOD蛋白的多序列比对Fig.5 Multiple sequence alignment of PtMn-SOD protein with Mn-SOD of other fungi注:加框部分为Mn-SOD蛋白的特征位点。

在NCBI数据库中下载15种担子菌(奥氏蜜环菌(Armillariasolidipes)、高卢蜜环菌(Armillariagallica)、乳白蛋巢菌(Crucibulumlaeve)、灰光柄菇(Pluteuscervinus)、草菇(Volvariellavolvacea)、蟹味菇(Hypsizygusmarmoreus)、荧光小菇(Mycenachlorophos)、香菇(Lentinusedodes)、晶粒鬼伞(Coprinusmicaceus)、糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)、Heterobasidionirregulare、毛韧革菌(Stereumhirsutum)、绒毛栓菌(Trametespubescens)、茯苓(Wolfiporiacocos)和硫磺菌(Laetiporussulphureus))的Mn-SOD蛋白氨基酸序列,将这些序列与PtMn-SOD蛋白氨基酸序列进行同源性比对,采用邻接法构建系统进化树。如图6所示,该系统发育树由两个大聚类组成,其中绒毛栓菌、硫磺菌和茯苓三个多孔菌科的担子菌组成一个大聚类,另外13种担子菌组成另一个大聚类。在这13种担子菌中,又分为三个小聚类,其中虎奶菇、糙皮侧耳和晶粒鬼伞组成一个小聚类,PtMn-SOD与同属于侧耳属的糙皮侧耳的进化距离最近。聚类分析表明,虎奶菇与糙皮侧耳亲缘关系较近,可能由同一个始祖进化而来。

图6 基于16种真菌Mn-SOD蛋白氨基酸序列的系统发育树Fig.6 Phylogenetic trees based on the amino acid sequences of Mn-SOD protein from 16 kinds of fungi

运用在线软件DAS-TMfilter进行跨膜结构预测可知,PtMn-SOD蛋白没有跨膜结构域,属于非跨膜蛋白。信号肽的预测和分析有助于理解蛋白质亚细胞定位。用在线软件SignaIP 4.0预测了PtMn-SOD蛋白属于非分泌蛋白,没有信号肽,这说明PtMn-SOD蛋白可能是在细胞膜内发挥作用(图7)。这和跨膜结构域预测的结果一致。Psort软件预测表明,PtMn-SOD蛋白定位于线粒体,推断该基因编码的蛋白是一种线粒体蛋白,在线粒体内发挥功能,参与超氧阴离子的清除反应。

图7 信号肽预测Fig.7 The prediction of signal peptide

通过SOMPA预测PtMn-SOD蛋白的二级结构,其二级结构包括41.82%的α-螺旋、15.45%的延伸链和42.73%的无规卷曲。如图8所示,螺旋和无规卷曲是PtMn-SOD蛋白最大的结构元件,贯穿于整个蛋白质结构中,而延伸链较少,分散其中。

图8 二级结构预测Fig.8 Secondary structure prediction

线虫的Mn-SOD蛋白(PDB ID:4X9Q)[24]与PtMn-SOD蛋白序列相同部分超过60.85%,因此该线虫的Mn-SOD蛋白可以作为同源建模的模板。依据同源建模的方法,借助Swiss-model,以该线虫的Mn-SOD蛋白为模板,对PtMn-SOD蛋白进行三维结构预测并构建3D模型(图9)。蛋白的三维结构很可能主要是由α-螺旋、延伸链和无规卷曲组成,与二级结构预测分析结果一致。该蛋白以同源四聚体的形式存在,可结合4个锰离子。蛋白的三维结构更进一步证明已成功获得虎奶菇Mn-SOD基因PtMn-SOD。

图9 PtMn-SOD蛋白的三维立体结构Fig.9 3-D structure of the deduced protein of PtMn-SOD

3 结论

以虎奶菇菌丝体为材料,通过研磨、超声、硫酸铵沉淀和透析,提取Mn-SOD。用WST-8法测Mn-SOD酶活力虎奶菇Mn-SOD酶活力为1.66个酶活力单位。用H2O2鉴定虎奶菇SOD的类型，酶经过H2O2处理后仍然有一定的活性,与未处理无明显差异,表明虎奶菇中SOD主要是Mn-SOD。通过同源克隆、RACE技术和FPNI-PCR等方法从虎奶菇中克隆获得一个PtMn-SOD基因,进行生物信息学分析。分别从基因序列、编码蛋白的功能位点和编码蛋白三维结构等方面,证明获得的是SOD基因中的Mn-SOD基因。通过生物信息学,研究了PtMn-SOD的理化性质和结构特征。PtMn-SOD基因序列可以用于构建重组质粒,转移到大肠杆菌等目标菌体中表达,为构建产Mn-SOD基因工程菌奠定基础,从而进一步研究Mn-SOD的理化性质,增加Mn-SOD产量。虎奶菇Mn-SOD的提取鉴定与基因的克隆为Mn-SOD产品的深入开发和利用提供了帮助。