以米糠、麸皮为基质的灵芝液态发酵动力学模型研究

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

灵芝生物活性成分复杂,现已从灵芝子实体、菌丝体和孢子中分离出279种具有药理作用的活性物质,其中主要为多糖、三萜、多肽蛋白、生物碱、核苷等[1-2]。灵芝作为一种广泛应用于中医临床的药物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、调节血糖血脂、增强免疫力、保护神经等药理作用[4-10]。灵芝子实体栽培周期长,易受环境、季节等因素影响,现较多采用发酵的方式获得灵芝菌丝体,发酵周期更短,过程易控制,更符合工业化生产需求[11-12]。目前对于灵芝发酵的研究报道多关注于对发酵培养条件的优化,或对发酵产物的提取纯化及结构功能等方面,而对发酵的过程研究较少[13-16]。

米糠、麸皮是水稻和小麦的加工副产物,米糠、麸皮在我国有着广泛的来源,目前这种低廉原料多被用作饲料、发酵辅料或从中提取有利成分,其综合利用率不足20%[17,23]。Souza等[24]在饼干配方中加入不同比例的米糠,得到纤维、γ-谷维素和叶黄素含量均更高的米糠饼干。Feng等[25]用土曲霉CICC40205突变体生物转化麦麸,生产衣康酸。

灵芝作为一种白腐真菌,能产生多种木质纤维素降解酶,将复杂的木质纤维素底物降解为简单的糖,并作为生物燃料加以利用[26]。本研究以一株诱变得到的发酵性能较优的灵芝菌株为研究对象,利用生物降解将米糠、麸皮用于生产价值更高的灵芝原料,并通过构建液态发酵过程中灵芝菌体生长动力学模型[27],深入了解灵芝液态发酵过程中菌体生长规律,为其工业化生产提供理论支持。将复杂的木质纤维素底物降解为简单的糖,以产生未来的生物燃料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灵芝GanodermalucidumJSU LIUYU18 本课题组紫外诱变所得(保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:M 2018908);马铃薯 市售;米糠 粉碎后60目过筛,购于镇江市丹徒区三山米厂;麸皮 粉碎后60目过筛,购于镇江市丹徒区面粉加工厂;蛋白胨、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、琼脂、葡萄糖、浓硫酸、苯酚等 均为分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司。

HVE-50高压灭菌 上海赛默生物科技有限公司;SF-CJ-2AG净化工作台 上海三发科学仪器有限公司;HSX-150恒温恒湿培养箱 上海海向仪器设备厂;HYL-C组合式摇床 太仓市强乐实验设备有限公司;721G可见分光光度计 上海恒勤仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 灵芝发酵培养方法 在超净工作台中,从保藏的灵芝菌株固体斜面上,切割一个边长为0.4 cm的正方形菌块,将其转接到准备好的PDA[14]平板上,28 ℃培养6 d。培养完成后,从平板上切割10个菌块转接至PD液体培养基中,120 r/min、28 ℃培养6 d可得种子液。再将种子液接种至发酵培养基中(按各因素水平参数设置进行配制),接种量10%,120 r/min、28 ℃培养7 d。

1.2.2 菌丝干重测定方法 发酵完成后,发酵液经60目网筛过滤,滤出物于50 ℃烘干至恒重称重得到菌丝干重。

1.2.3 灵芝液态发酵菌丝体生长经验动力学模型方程的研究 以培养基中米糠、麸皮、磷酸二氢钾、七水硫酸镁添加量和发酵时间为因素进行均匀试验设计,同时将米糠和麸皮总量限定为10 g(每100 mL培养基中用量,下同),即将米糠和麸皮作为一个因素。以菌丝干重作为评价指标,利用SPSS线性回归得到灵芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液态发酵菌体生长经验动力学模型方程。根据均匀试验设计标准试验次数须大于15,考虑到时间安排的合理性,采用U24(244)均匀设计进行发酵试验。各因素范围:米糠0.4～9.6 g、磷酸二氢钾0.015～0.36 g、七水硫酸镁0.015～0.36 g、时间0.5～12 d,共24个水平。

1.2.4 灵芝液态发酵菌体生长理论动力学模型方程的研究 Logistic模型曲线呈S型,能较好地反映微生物生长随时间的变化规律,具有一定的适用性[17]。Logistic方程为:

式(1)

式中:Cx,0为初始菌丝体浓度,测得为0.208 g/100 mL;Cx,max为最大菌丝浓度,单位g/100 mL;μm为最大比生长速率,单位d-1;t为时间,单位d。

本研究所得的灵芝菌体生长经验动力学方程是关于培养基各成分及发酵时间的函数方程,利用Excel对此方程进行计算可得到特定培养基条件下,菌丝干重随时间变化的预测值。培养基条件设置采用U16(163)均匀试验设计,各因素范围:米糠0.6～9.6 g、磷酸二氢钾0.02～0.32 g、七水硫酸镁0.02～0.32 g,时间设置为1～12 d。用SPSS非线性回归代入Logistc方程得到对应条件下参数μm和Cx,max的值,再进行线性回归即可得到参数μm和Cx,max关于培养基各成分的表达式,将其代入Logistic方程即可得灵芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液态发酵菌体生长理论动力学模型方程。

1.3 数据分析

利用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,所有实验数据均为三个平行样品的平均值,结果表示为平均值±标准差。本研究中采用的均匀设计表均来自联合国际学院https://uic.edu.hk//～isci/Uniform Design/table/Un_n%5es.html。

2 结果与分析

2.1 U24(244)均匀试验结果

按表1实施U24(244)均匀试验设计,发酵完成后测得菌丝干重结果如下:

表1 U24(244)均匀试验参数控制表及试验结果Table 1 Parameters control table andresults of uniform design U24(244)

在表1中菌丝干重是在不同米糠用量、磷酸二氢钾用量、七水硫酸镁用量和时间组合下进行发酵得到的结果,但各因素的影响无法以此说明,故利用SPSS进行后续分析,并构建动力学模型。

2.2 灵芝液态发酵菌丝体生长经验动力学模型方程的构建

表4 回归方程系数显著性分析Table 4 The analysis of regression equation coefficient significance

SPSS线性回归得到的灵芝液态发酵菌丝体生长经验动力学模型方程为:

y=1.836+3.983x3+0.25x4-0.439x1x2-0.423x1x3+0.011x1x4+10.704x2x2-8.82x2x3-0.013x4x4

式(2)

表2 回归方程拟合度分析Table 2 The analysis of regression equation fitting degree

表3 回归方程显著性分析Table 3 The analysis of regression equation significance

2.3 灵芝液态发酵菌丝体生长理论动力学模型方程的构建

将表6中的培养基条件参数代入式(2)得到菌丝干重在不同培养基条件下随时间变化的预测值,单位为g/100 mL,结果见表5。

表5 不同培养基条件下菌丝干重的预测值Table 5 The predicted value of mycelia dry weight in different medium conditions

将表5中的时间和菌丝干重预测值代入式(1),通过SPSS非线性回归得到不同培养基条件下Logistic模型方程参数μm和Cx,max估计值,结果见表6。不同培养基条件按U16(163)均匀试验设计进行参数控制,见表6。

表6 U16(163)均匀试验参数控制表及不同培养基条件下参数μm和Cx,max估计值Table 6 Parameters control table of uniform deignU16(163) and estimated values ofμm and Cx,max in different medium conditions

以x1、x2、x3及其二次项x1x1、x1x2、x1x3、x2x2、x2x3、x3x3为自变量,参数μm和Cx,max为因变量,利用SPSS线性回归得到关于培养基各成分的回归方程。回归方法选择“向后”,设置使用F的概率“进入为0.05,删除为0.1”。

表7 回归方程拟合度分析Table 7 The analysis of regression equation fitting degree

表8 回归方程显著性分析Table 8 The analysis of regression equation significance

由表9可得参数μm的回归方程为:

μm=3.283+0.104x1+3.51x3-0.025x1x1-0.612x1x2-0.418x1x3+10.101x2x2-7.229x2x3

式(3)

表9 回归方程系数显著性分析Table 9 The analysis of regression equation coefficient significance

表12 回归方程系数显著性分析Table 12 The analysis of regression equation coefficient significance

表10 回归方程拟合度分析Table 10 The analysis of regression equation fitting degree

表11 回归方程显著性分析Table 11 The analysis of regression equation significance

由表12可得参数Cx,max的回归方程为:

Cx,max=2.891+0.033x1+3.882x3+0.006x1x1-0.386x1x2-0.406x1x3+11.144x2x2-8.604x2x3

式(4)

将式(3)和式(4)代入式(1),即可得到灵芝液态发酵菌丝体生长理论动力学模型方程:

μm=3.283+0.104x1+3.51x3-0.025x1x1-0.612x1x2-0.418x1x3+10.101x2x2-7.229x2x3

Cx,max=2.891+0.033x1+3.882x3+0.006x1x1-0.386x1x2-0.406x1x3+11.144x2x2-8.604x2x3

式中:x1、x2和x3分别为发酵培养基中米糠、磷酸二氢钾和七水硫酸镁的用量,单位g/100 mL;t为发酵时间,单位d。

在经验和理论动力学模型方程中,x1直接或与其他项的交互作用显著影响因变量,即培养基中米糠和麸皮用量的配比会影响发酵结果,原因可能是麸皮中总膳食纤维含量比米糠更高。有研究表明,灵芝优选木质纤维素含量高,且含氮量低的底物[28],因为灵芝生长代谢过程中会分泌木质纤维素降解酶,将底物中的木质纤维素降解成更易于吸收利用的营养物质,故可以认为麸皮比米糠更有利于灵芝菌体的生长繁殖,此结论与前期培养基优化试验的结果一致。

2.4 灵芝菌丝体生长经验与理论动力学模型的比较

将前期优化实验得到的发酵培养基条件(米糠1 g/100 mL、麸皮9 g/100 mL、磷酸二氢钾0.15 g/100 mL和七水硫酸镁0.15 g/100 mL)代入灵芝Ganoderma lucidum JSU LIUYU18液态发酵菌体生长经验动力学和理论动力学模型方程,在同一水平将两模型方程与实测值进行比较，论证其可靠性。以发酵时间为横坐标,菌丝干重为纵坐标,绘制菌丝体生长经验动力学模型曲线和理论动力学模型曲线。

由图1可知,在0～3 d经验动力学模型曲线与理论动力学模型曲线相差较大,原因可能是在发酵初期,由于灵芝菌体进入新的培养基环境,此阶段主要满足菌体自身生长所需,底物消耗少,导致菌丝分离不彻底;同时丝状真菌在生长初期会有一个快速生长期,此时期菌体的新陈代谢活跃,生长状态变化较快,而两个动力学模型均基于每12 h取一次样的数据所得,导致其不足以反应灵芝菌株在快速生长期的变化,在第3 d后,两模型的菌丝干重预测值基本一致。

表13 单因素方差分析结果Table 13 The results of one-way anova

图1 经验和理论动力学模型曲线Fig.1 The curve of empirical and theoretical dynamic model

将实测值、经验动力学模型和理论动力学模型两两进行比较,结果如下:

由表13可知,将实测值、经验动力学模型和理论动力学模型两两进行比较时,F均小于Fcrit,P均大于0.05,即三组数组间差异不显著。表明经验动力学模型和理论动力学模型与实测值之间没有显著差异,即得到的经验和理论动力学模型能较好地反映灵芝GanodermalucidumJSU LIUYU18菌体的生长状态。

3 结论

本研究通过U24(244)均匀试验设计得到不同条件下灵芝发酵后的菌丝干重,并利用SPSS回归分析得到灵芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液态发酵菌体生长经验动力学模型方程;本研究以Logistic方程为原型根据经验动力学模型得到灵芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液态发酵菌体生长理论动力学模型方程;通过比较两模型与实测值,结果表明两模型与实测值无显著差异,即两模型均能较好地反映发酵中灵芝菌体生长状况,为其工业化生产提供理论指导。