深圳地区育龄人群G6PD基因突变谱特征分析

郭昭鹏 吴群燕 陈仕国 林 圣 郑开封 苏进娣 姚克勤 段 山*

1. 深圳市罗湖区妇幼保健院(518019)；2.深圳市卫生健康发展研究中心

葡萄糖-6磷酸脱氢酶( G6PD)缺乏症是世界范围内常见的遗传性疾病，是由G6PD基因中的点突变导致酶活性的异常。广东省是中国南部沿海人口最多的省份，一直被称为“百种族”，G6PD缺乏症发生率为3.1%～16.1%[1]，在深圳地区具有比较高的发病率[2-3]，但以往的研究没有对深圳地区的致病基因突变谱进行大规模人群系统分析。为了今后能高效开展本地区G6PD缺乏症基因筛查，本研究在深圳地区育龄人群中开展了G6PD缺乏症致病相关基因突变谱的筛查。

1 对象和方法

1.1 研究对象

来自深圳原罗湖区和原龙岗区计划生育中心体检育龄夫妇的静脉血样本共6389例，其中经过G6PD/6GPD比值法初筛G6PD阳性样本749例及未经酶活性筛查的样本5640例。本研究经深圳市卫生健康发展研究中心伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1G6PD/6PGD比值法采用G6PD测定试剂盒(广州科方生物技术有限公司)，在COBAS8000全自动生化免疫分析系统(ROCHE, USA)上进行G6PD酶活性检测。正常参考值为1.00～2.30；<0.95为G6PD缺乏，判断为阳性；>1.05为G6PD酶活性正常，判断为阴性；0.95～1.05为可疑，予以复查后判定。

1.2.2ARMS-PCR法通过优化引物和扩增条件，检测中国人常见的6种基因突变型：c.1376 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.871 G>A、c.392 G>T、c.1024C>T[4]。抽取10%的样本进行sanger测序验证ARMS-PCR法检测的准确性，结果100%准确，没有发现检测错误样本。

1.2.3二代测序(NGS)用ARMS法排除6个常见位点的样本后进行NGS全序列测序检测，扩增方案见参考文献[5]。NGS全序列测序分析见参考文献[6]。数据分析采用Ion Torrent PGMTM服务器配套的Ion Torrent Software Suite数据分析软件对电信号进行捕获和转换，并结合自带插件coverageAnalysis和variantCaller对测序结果进行初步分析。

2 结果

2.1 基因突变类型

6389例样本中发现1180例存在基因突变， 检出23种基因突变类型。女性样本中检出14例纯合子(1388G>A纯合突变 7 例， 1376G>T 纯合突变 7例)及28例双重杂合子(c.95 A>G/c.1376 G>T复合突变8例、c.95 A>G/c.1388 G>A复合突变7例、c.1376 G>T/c.1388 G>A复合突变13例)。见表1。研究还发现了4例新突变类型，分别为c.460A>G、c.226A>C、c.-6T>C、c.452C>G，见表2。

表1 6389例样本ARMS-PCR结合NGS全序列分析检出基因突变类型

表2 4例未见报道基因突变类型及G6PD/6PGD比值法检测结果

2.2 基因突变率

5640例样本检出有基因突变442例，占7.8%，其中男性148例，占男性样本10.0%(148/1479)；女性294例，占女性样本7.0%(294/4161)。

2.3 漏诊率和假阳性率

经酶活性检测的5640例中，阴性5280例(男性1331例、女性3949例)中发现基因突变率1.8%(96/5280)，其中男女性漏诊率分别为0.3%(3/1331)和2.4%(93/3949)。而在酶活性检测为阳性的360例(6.4%)及之前收集的749例G6PD阳性样本中，共计有25例经过全序列测序分析未发现基因突变，误诊率为2.2%(25/1109)。

3 讨论

G6PD缺乏症，俗称蚕豆病，是由于编码红细胞中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的基因突变，引起溶血性贫血的一种遗传性酶缺乏病[7]。G6PD 基因突变具有明显的地区和种族异质性，在我国其分布呈“南高北低”的趋势，患者主要分布在长江以南各省，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高，其发病率可达 4.2%～15.7%[8]。编码G6PD的基因突变类型以点突变为主，世界各地已发现超过200种异常G6PD基因型，中国人群已发现35种[9]。本研究历时3年，共计对6389例孕前筛查的育龄人群开展了ARMS-PCR法结合NGS全序列分析方法检测G6PD基因突变的研究，取得了本地区G6PD基因突变谱的第一手资料。

3.1 中国深圳地区育龄人群G6PD基因突变类型的流行特征

本研究中得到G6PD缺乏症酶活性异常率为6.4%，G6PD缺乏症的基因型突变率为7.8%，其中男女性占比分别为10.0%和7.0%，高于佛山、东莞、潮州等广东省其他地区报道的G6PD基因突变率[10-12]。结果的差异性可能与样本量和地区人群起源的差异有关。G6PD在不同种族和人群中的致病基因突变类型和发生频率有高度遗传异质性。本研究共对6389例样本进行基因突变筛查的结果发现，本地区常见突变类型构成比与中国南方人群常见的12种突变类型基本相符[13]。检出的c.592C>T、c.1360C>T、c.487G>A、c.949G>A,突变分别在印度、意大利和东南亚较为常见[14]。本研究检测出1例突变类型为c .592C> T，据报道是中国侗族最常见的突变类型，占侗族G6PD基因突变的50%以上[15]。目前报道东南亚种群中常见的突变类型为c.95A>G，c.392G>T，c.1360C>T，c.1376G>C，c.1388G>A和c.871G>A[16]。本研究结果同样显示具有亚洲种群的突变特征，同时又发现较多中国人群罕见的突变类型，说明深圳地区作为一个年轻的移民城市，由于汇聚了来自全国各地的新移民，从遗传学角度看本地区人群具有高度的遗传异质性和代表性，因而有许多中国人罕见的基因突变类型得以在本地区人群中检出。这也提示深圳地区人群是筛查中国人群常见遗传性疾病基因突变谱的理想人群。G6PD全基因序列测序发现的c.460A>G、c.226A>C、c.-6T>C、c.452C>G，4个基因突变经过Pubmed、HGMD、dbSNP、LOVD、Ensembl数据库检索均未发现报道。

3.2 G6PD基因检测方法比较

目前，诊断G6PD缺乏症主要的检测方法包括酶活性检测法和基因检测法两大类。临床上多采用酶活性检测法[17]。G6PD/6PGD比值法对于女性杂合子的漏检率约在20%[18]。

ARMS-PCR是一种常用检测已知点突变的方法，具有简单、省时、经济、准确优点[19]。本研究首先用ARMS-PCR法对6389例样本进行G6PD基因的6个常见突变位点进行快速低成本筛查，大大节约了研究的时间成本和经济成本。二代测序(NGS)[20]由于测序成本较高，目前的报道中尚未见将这一方法大规模用于临床检测。但由于其在高通量、全基因范围内筛查已知和未知突变方面的独特优势，本研究采用本课题组开发的长片段PCR捕获结合NGS测序的目标序列测序方法对未筛查到常见突变的样本进行了G6PD基因全基因序列测序分析，测序范围包括基因前后端5000bp范围的基因表达调控区及所有外显子内含子区域，以便能够全面筛查可能存在的中国人群罕见G6PD突变和/或未知突变。

本研究对5640例样本先进行G6PD/6PGD比值法鉴定后再予以基因法检测，G6PD/6PGD比值法漏诊率1.8%，误诊率为2.2%。原因可能有以下几点：①不同基因突变导致的酶活性缺乏的表现度不一。②女性杂合子突变由于X染色体随机失活或者DNA甲基化程度各异导致酶活性的缺失程度差异较大。G6PD/6PGD比值法检测结果靠近正常临界值甚至正常，需要在G6PD/6PGD比值法检测的基础上结合基因突变检测来提高G6PD缺乏症的筛查准确率。

本研究在部分G6PD/6PGD法检出的G6PD酶活性正常样本中用本方法也检测出编码区的有效错义突变，是目前较为全面和可靠的方案。本研究发现的4例尚未见报道的基因突变类型，除了c.460A>G突变女性携带者酶活性正常外，其它3种突变的男性携带者其酶活性都显著下降，由于 X 染色体随机失活,携带G6PD 基因突变的女性杂合子会形成酶缺乏红细胞与正常红细胞的嵌合，故其酶活性差异较大。它们与G6PD致病的相关性以及造成的酶缺乏程度等致病机制有待进一步实验研究揭示。

综上所述，本项研究在深圳地区开展了较大规模的系统性G6PD基因突变筛查研究，获得了较明确的深圳地区常见的G6PD基因突变谱。并对G6PD/6PGD比值法筛查G6PD缺乏症的漏诊率和误诊率进行初步统计分析。对改进现有临床G6PD/6PGD比值法提供数据和技术支撑，为研发适合本地区出生缺陷预防的G6PD缺乏症基因诊断试剂盒提供理论基础。

(志谢：深圳市人口基金会为本研究项目提供的研究资金支持)