中国临床微生物实验室应对重大传染病疫情能力建设指导原则

■ 中国医院协会临床微生物实验室专业委员会

重大传染病疫情是指某种传染病在短时间内发生、波及范围广泛，出现大量的病人或死亡病例，其发病率远远超过常年发病率水平的情况。近年来，全球范围重大传染病疫情时有暴发，不但严重威胁人类生命健康，还对经济发展、社会稳定和国家安全造成巨大影响，防控形势非常严峻。

临床微生物室的主要工作是感染的病原学诊断、病原菌药敏试验和耐药性监测及医院感染追踪溯源，在重大传染病的诊断、治疗和防控中发挥着至关重要的作用。在我国，传统临床微生物实验室能力建设偏重于对细菌和真菌的检测，而引发重大传染病疫情的微生物复杂多样，既包括细菌、真菌，也包括病毒（如布尼亚病毒、新型冠状病毒）、衣原体（如鹦鹉热衣原体）、立克次体（如斑点热立克次体）和寄生虫（如血吸虫）等；在发生重大疫情时既要关注病原体目标治疗，也要关注抗菌药物合理应用。新的形势对临床微生物实验室的综合能力提出了新的挑战，急需提升检测技术，扩展病原体检测范围，延伸应急服务功能。为此，中国医院协会临床微生物实验室专业委员会特组织专家讨论制定本指导原则。

1 建筑与布局

在重大传染病疫情暴发时，临床微生物实验室在病原学诊断中发挥着“前哨”作用，其工作具有风险性高和技术性复杂等特点。为了提高工作效率，保障人员和环境安全，在建筑与布局上应满足以下基本要求：（1）能相对独立地进行标本接收、处理和检验，以及医疗废弃物高压灭菌等工作，尽量将实验室生物安全风险降至最低；（2）有足够的实验室空间开展病原体综合检测技术；（3）有足够的辅助空间储存试剂、消毒剂、防护用品及生物样本；（4）流程设计应遵循“单向工作流程”原则, 防止潜在的交叉污染[1]，确保检测过程的安全和高效；（5）在建筑设计上预留新技术应用的空间，适应未来发展的要求[2]。

目前我国临床微生物实验室建筑设计的最低要求是符合二级生物安全防护水平（BSL-2），结构设计应符合现行国家标准[3]，有条件的医疗机构应建设加强型医学 BSL-2实验室，即在普通型医学BSL-2实验室中设置缓冲间；独立机械通风系统，并经高效过滤器排风；实验室核心工作间比相邻区域最小压差不低于-10Pa；不设可开启外窗，保证围护结构的密闭性[4]。

2 实验室管理及生物安全

实验室获得性感染的危险因素包括：病原菌的致病力、感染剂量和暴露机会。主要暴露途径有吸入、摄入、接种（针刺）、皮肤和粘膜污染。实验室生物安全工作的核心是风险评估，三大措施是防护、消毒和灭菌[1]。

2.1 实验室管理

临床医疗机构应成立生物安全委员会，并由法人担任负责人。临床微生物实验室应设生物安全负责人，应组织编写生物安全手册和标准操作规程（SOP）；建立日常生物安全管理，包括：人员管理、标本管理、菌（毒）种管理、医用废物管理、实验室清洁消毒等规章制度；制定有效的实验室安全工作计划，教育培训，审核、评价和监督生物安全的执行情况。微生物室工作人员必须有录用前或上岗前的体检报告，管理人员依此进行职业健康评估，并妥善保存相关记录[1]。

2.2 风险评估

风险评估负责人应熟悉所涉及的微生物特性、设施及设备、操作规程以及生物安全防护要求，发生重大传染病疫情时，应依据《人间传染的病原微生物名录》[5],对拟从事的病原体检测进行风险评估。应考虑（但不限于）下列内容[6]：（1）已知或未知生物因子的特性，微生物的危害程度分级和种类，如埃博拉病毒、新疆出血热病毒等，属于危害程度第一类；鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、肺综合征汉坦病毒、新型冠状病毒等，属于危害程度第二类；（2）宿主来源；(3)传染性；(4) 传播途径，如呼吸道、消化道、接触、血液传播等。能引起重大传染病疫情的已知病原体传播途径见表1，有些病原体存在多途径传播，如布鲁菌可经气溶胶、粘膜接触和破损皮肤途径感染；（5）易感性（易感人群）；（6）感染潜伏期；（7）感染剂量；（8）致病性（包括急性与远期效应）；（9）在环境中的稳定性（选用有效消毒剂）；（10）预防措施及治疗方案等[7]。在病因不明的重大传染病疫情暴发时，应及时按照国家主管部门制订的生物安全指南，进行风险评估[8-9]。

2.3 生物安全设备

核心工作区的生物安全设备至少包括：（1）A2型Ⅱ级生物安全柜，30%气流通过HEPA过滤后经专门管道外排。开启、操作和处理所有经空气传播的致病性生物因子，及含高致病因子的标本时必须在生物安全柜内进行，安全柜应经过年检合格才可使用[1]；发生重大疫情时，应再确认生物安全柜的HEPA过滤器、气流速度等安全性能，确保合格；（2）下排气立式高压蒸汽灭菌器，所有可疑含高致病感染性因子的标本和物品必须在实验室内经高压灭菌后再处理；（3）离心时需用带安全离心桶或防护转子的离心机[1,6]。

2.4 个体防护装备

个体防护装备是减少操作人员暴露于气溶胶、迸溅物以及意外接触等危险的屏障。根据风险评估，操作可疑含高致病感染性因子的标本时，应根据病原体种类和传播途径，采取针对性防护措施。（1）当可能接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性材料的操作时，应戴大小适合的一次性医用乳胶手套；（2）当可能接触通过消化道或血液传播的感染性因子时，应佩戴医用外科口罩，工作服外面套反背式隔离衣，戴乳胶手套；（3）当操作可能通过气溶胶、粘膜及皮肤接触传播的病原体时，应佩戴医用防护口罩(N95、KN95)、护目镜和乳胶手套，根据需要外加连体带帽的隔离衣，必要时穿鞋套；（4）为防止眼睛或面部被迸溅物或紫外线伤害，必须戴医用护目镜、面罩（面屏）等防护设备；（5）重大传染病疫情时按政府部门或学术团体发布的生物安全防护要求进行防护。对于未知的、多传播途径病原体，做好全方位三级个人防护；（6）应遵循正确程序穿脱防护用品，污染区使用的防护用品不得穿离实验室[3,6]。

2.5 规范化操作

为避免实验室获得性感染，应规范微生物学操作技术，遵循以下原则但不限于：（1）所有操作应按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行；（2）应限制使用皮下注射针头和注射器；（3）防迸溅和泄露，一旦发生迸溅和泄露需及时用消毒剂去污染；（4）实验区应区分相对清洁区和污染区，实验操作尽可能在相应的区域进行；（5）在生物安全柜内进行的可产生气溶胶的操作，应限定在工作台面的中后部；（6）放入生物安全柜内的物品应使用70%酒精清除表面污染，在消毒剂浸湿的纱布上进行实验，以吸收可能溅出的液滴等[3,6]。

2.6 消毒和灭菌

去污、消毒和灭菌对实验室生物安全至关重要。根据化学消毒剂对微生物的作用效果不同，消毒剂可分为低效、中效和高效。细菌繁殖体、脂质病毒或中等大小病毒和部分真菌对低效消毒剂（如季铵盐类）敏感；非脂质病毒或小病毒须用中效以上的消毒剂（如70%酒精）才有效；高效消毒剂（如含氯消毒剂）对包括分枝杆菌在内的细菌繁殖体、病毒、真菌等病原体普遍有效[2]。

灭菌是指杀死和／或去除所有微生物及其孢子的过程[6]。实验室常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，所有感染性标本及污染的材料必须在离开实验室前，经清除污染及高压蒸汽灭菌后再交医疗机构统一集中处理，对灭菌效果应做化学及生物学监测[10]。

3 技术平台建设

技术平台是决定临床微生物实验室诊断能力的首要因素，应对重大传染病疫情检测技术平台在功能上需满足以下要求：（1）检测病原体种类广：不但可以检测目标病原体，也可以鉴别诊断其他相关病原体；不但可以检测已知病原体，也可以检测未知病原体。在检测病原体种类上应覆盖细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、寄生虫等所有微生物；（2）检测速度快：能及时发出报告，帮助临床做出确诊或排除诊断；（3）高通量：可同时检测大量标本和多种病原体，提高诊断效率；（4）自动化、智能化：减少人员感染风险，减少人为误差；（5）高敏感性和高特异性：保证检测结果准确。

由于重大传染病具有突发性、不确定性和紧迫性，病原体难以预测，需要综合使用形态学、培养、分子生物学和免疫学检测等多种技术，以相互补充、验证。主要检测技术平台如下。

3.1 形态学、培养和鉴定技术

形态学检测简单快速、成本低，可用于检测细菌、真菌和寄生虫，也可用于检测病毒、衣原体的包涵体等，可对部分传染性疾病进行初步诊断。培养可直接获得病原体，以便进行种属鉴定、药敏试验和流行病学调查，是传染病诊断的“金标准”。实验室应根据工作需要配备显微镜、自动染片机、细菌培养系统（包括血培养仪）、细菌鉴定和药敏分析系统、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）等设备[2]。

3.2 分子生物学检测技术

传统的形态学检测和培养技术敏感性相对较低、费时长、能检测的病原体种类有限，难以满足重大传染病快速诊断需求。近年来，不依赖培养的核酸检测技术使病原学诊断方法发生了根本性的变革，在某些传染病诊断中已逐渐取代培养成为“金标准”。分子生物学技术主要分为两类，一类是靶向检测，如PCR、多重PCR或微流控芯片等技术，可用于检测一种或多种已知病原体；另一类是非靶向检测，如宏基因组测序，可检测未知病原体，也可发现和鉴定新的病原体。2019新型冠状病毒（2019-nCOV）就是通过基因测序检出冠状病毒，并经过序列比对确定为是一种不同于既往已知的冠状病毒。为了应对今后随时可能发生的重大传染病疫情，我国临床微生物实验室迫切需要加强分子生物学平台建设。建筑空间允许的医疗机构可以在微生物实验室内建立标准的PCR试验区[11]，没有建筑空间的医疗机构可以优先选配“样本进、结果出”的自动化分子检测设备，以及针对特殊病原体检测的小型床旁即时（POCT）分子检测设备（如一体化多重PCR检测仪、微流控芯片检测仪）等。地区性的检验中心可配备宏基因组测序技术平台[2,12]。

3.3 免疫学检测技术

免疫学检测结果可对培养和核酸检测结果进行补充和验证。常用的免疫学检测技术包括酶联免疫、化学发光免疫和胶体金免疫层析等。酶联免疫法操作较繁琐，检测速度较慢，但检测成本较低，适用于大规模流行病学调查。化学发光法具有敏感性高，自动化，检测速度快、定量检测等优点，可对患者体内抗原/抗体水平进行动态观察，有助于疾病的判断。胶体金免疫层析法简单、快速、方便、经济，虽然敏感性相对较低，但无需特殊设备，尤其适用于基层医疗机构、门诊等快速筛查。实验室可根据标本数量、检测性能要求选择不同的检测方法[12]。

4 人员能力建设

人员能力是临床微生物实验室诊断能力的决定性因素。应对重大传染病疫情，临床微生物工作人员需经过较系统的微生物学、传染病学和实验诊断学知识培训，应具备以下知识和能力。

4.1 熟知传染病相关法律法规

我国传染病报告、生物样本、菌（毒）株保存和运输相关法律法规主要包括《中华人民共和国传染病防治法》《突发公共卫生事件应急条例》《突发公共卫生事件与传染病监测信息报告管理办法》《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》等[13-14]。应按照相关法律法规和行业标准制定SOP文件，并进行规范操作和报告。

4.2 准确识别疫情相关的异常检测结果

我国重点监控的重大传染病疫情包括：（1）甲类传染病，鼠疫和霍乱；（2）乙类按甲类管理的传染病，如非典型肺炎、肺炭疽、人感染高致病性禽流感、脊髓灰质炎、新冠病毒肺炎；（3）已消灭或被控制传染病死灰复燃，如天花、脊髓灰质炎；（4）新发传染病和不明原因的疾病暴发流行，如埃博拉出血热、新冠肺炎；（5）人畜共患疾病流行，如鼠疫、炭疽等。检验人员在日常工作中检出相关病原体时要严格审核，及时提交当地疾病预防控制中心确认，不得擅自发布[13-15]。

4.3 指导临床采样送检

能根据患者临床症状、传播途径等信息初步判断可能感染的病原体，指导临床进行正确的标本采集、转运和选择适当的检测方法。重大传染病疫情常见传播途径、病原体及检测方法见表1[2,16]。

4.4 熟练应用病原学检测技术

微生物检验人员不但需要有能力进行传统的细菌真菌涂片镜检、培养和药敏试验，还要能够熟练进行核酸提取、PCR扩增等分子生物学技术，以及快速免疫学检测技术操作。了解各种技术的实验原理、技术性能、质量保证、结果解释和方法学局限性等。

4.5 具备应急检验能力

重大传染病疫情暴发时各医疗机构应立即组建应急检验队伍，应急检验队伍人员应具备良好的身体素质、心理素质和专业素质。开展工作前要进行强化培训并获取相关培训合格证。内容包括：引发本次疫情的病原体生物学特性和消毒灭菌方法、标本处理流程、相关试剂和仪器的使用、检测方法及质量保证、生物安全防护要求及个人防护用品的正确使用、生物安全柜操作流程、实验室菌毒种或生物标本保存方法和安全要求、医疗废弃物处置要求等[17]。

5 质量保证

对于临床微生物实验室来说，不但要注重技术平台等硬件建设，还要注重检验全程质量保证。检验前高质量的标本采集和运送是准确病原学诊断的重要保证；检验中应通过室内质量控制监测结果的重复性和稳定性；检验后应进行结果审核和报告，并做好结果解释。实验室应定期通过参加外部质量评价（室间质量评价，EQA)了解检验结果的正确性，考核实验室检测能力[18]。

5.1 检验前的质量保证

发生重大传染病疫情时，临床微生物室应及时编写和发布标本采集标准操作手册（SOP）。标本采集总原则：标本必须来源于感染部位，应使用最佳的采集方式获得的标本种类（如组织，抽吸物等），避免感染部位附近的皮肤或粘膜定植菌群的污染。标本量尽可能满足项目检验的要求，针对不同的检测方法（传统微生物检验方法、分子检测或宏基因组测序），应根据患者感染类型，在合适的时间、合适的部位、用合适的采集和运送方式（运送拭子/运送培养基/保存液、运送时间、环境温度及气体条件）采集和运送标本[2]。

对于重大传染病疫情的标本采集和运送，应遵循当时的重大传染病指南操作[6,9]。（1）医疗机构内有专人进行标本运送：标本应置于安全防漏的A类标本转运箱（UN2814)进行运送，保证严密不泄露，标本箱应有特殊生物安全标识，运送人员应按相应的风险评估进行个人防护；（2）不建议使用建筑内气动标本桶传递，除非必要时，应保证运送轨道运转正常，按A类运输标本的双层防渗漏包装，标本传输桶外有特殊生物安全标识；（3）在机构间的运送方式应符合国家/国际运输安全规定，应具有相关管理部门签发的转运许可证。确保样本的完整性以及承运人、公众和接收实验室的安全；（4）标本信息的交接最好采用电子方式，以减少污染。

5.2 方法学性能验证

临床微生物实验室应根据实验方法学做好新项目性能验证预案。新发传染病疫情发生初期，有能力的实验室可以参照WHO或疾控中心提供的PCR引物自建体系，应反复优化并与临床诊断相验证。当有国家药品监督管理局（NMPA）批准的试剂上市时，实验室应首先作方法学确认，证明试验如预期操作，并达到预期结果和用途。其次作方法学性能验证[19]。

分子生物学方法的分析性能验证，定量检测方法至少应包括精密度、正确度、线性、测量/可报告范围、抗干扰能力等。定性检测方法至少应包括测定下限、特异性、准确度、抗干扰能力等。应使用验证过的核酸抽提和纯化方法[20]。

免疫学方法的性能验证，评价灵敏度、特异性和阴性/阳性预测值非常重要。应关注检测人群的疾病流行病学数据，以及该检测试验是筛查试验、诊断试验还是确证试验。筛查试验应具有高灵敏度，并用于高患病率人群的检测；确证试验应具有高特异性[2]。

检测方法在与临床诊断相验证时，还需确定检测方法的临床效能，确定临床用途时要考虑该方法的限制性。检测结果可与当地疾病预防控制中心的检测结果对照，并与临床诊断标准进行符合性比较，综合考虑检测的敏感度和特异性，可采用两种试剂同时检测以减少漏检或误检。

5.3 质量控制和质量评价

临床微生物实验室应常规制订室内质量控制计划, 对实施内容、方式、责任人做出明确的规定，并给出结果评价依据。质量控制计划应尽可能覆盖实验室的所有检测项目和所有检测人员。当发生重大传染病疫情时，应及时建立专项检测的标准操作手册，包括标本采集、仪器操作、试验方法、结果判读、报告和注意事项等。如新冠肺炎疫情期间，国家卫生健康委强调应“加强实验室室内质控，常态化接受国家级或省级临床检验质量控制”[17]。此外，各实验室应关注并积极参加针对重大疫情开展的专项室间质评活动，实验室管理层应监控外部质量评价结果[18]。

6 临床研究能力提升

重大传染病疫情是危害全球的突发公共卫生事件，国家给予强有力的科研支持计划。如针对新冠肺炎疫情，国家自然科学基金委员和国家科技部先后发布了“新型冠状病毒（2019-nCoV）溯源、致病及防治的基础研究”专项项目指南和“新型冠状病毒(2019-nCoV)现场快速检测产品研发应急项目申报指南的通知”，各省市科技厅和高校也发布了相应的科研项目指南。这些指南要求紧密围绕新型冠状病毒感染的病原学、流行病学、发病机制、疾病防治等相关重大科学问题，开展基础性、前瞻性的联合研究。鼓励学科交叉，用新的科研范式理念系统解决关键科学问题。其中与检验关系最为密切的是检测产品研发，要求围绕疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查这一核心目标进行研发，迅速提升检测能力。临床微生物检验人员应该根据新冠病毒科研项目指南审视我们在科研基础和技术储备中的不足，提升科研能力。

表1 重大传染病疫情常见传播途径、病原体及检测方法

6.1 安全规范地保存样本

样本是推进生物医学发展的重要资源，对中国体外诊断产品的发展至关重要，是基础医学、临床医学和转化医学研究的基石。针对重大传染病疫情中检测的标本应严格按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》在卫生行政部门备案申请保存，并按相关规定使用和管理。检验人员一方面要做好临床样本（包括患者和疑似患者的连续样本）的收集、处理及存储[21]；另一方面要做好临床样本的信息数据收集，包括临床电子病历和影像学资料等，要对每个临床样本及其相关数据可定位、可溯源。

6.2 加强技术储备和转化研究

应对重大传染病疫情需要综合使用传统微生物学、分子诊断和免疫学检测等多种技术。临床微生物检验人员应以提高检测速度和检测敏感性、准确性为结果导向，积极与临床、企业、疾控中心和科研院所合作，创新思路，改进技术。有条件的实验室要建立核酸检测研发平台（如荧光定量PCR法、恒温扩增法、RNA捕获探针法、杂交捕获免疫荧光法等）和抗体快速检测研发平台（如荧光定量层析法、胶体金层析法等）。实现平战结合，提升科研能力。