基于网络药理学探究中药川芎治疗高血压的药理作用机制

晏相如 丁雨点 李顺利 杨豆豆 何绪华 蒋文雯

贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025

近10年来，随着现代基因组学、蛋白质组学、代谢组学等“组学”理论的发展，系统生物学视角的引入以及生物信息学的应用,网络药理学 (Network Pharmacology) 概念应运而生[1-2], 它是在系统生物学与计算机技术高速发展的基础上发展起来的, 基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础上, 通过网络分析, 系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响, 揭示多分子药物协同作用于人体的奥秘[3]。这与中医学从整体的角度去诊治疾病的理论, 中药及其复方的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理殊途同归, 无疑为跨越中西医间的鸿沟架起了桥梁, 为中医药的现代化和国际化指明了方向。

川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，具有活血行气，祛风止痛的作用[4]。川芎主要含有挥发油、生物碱、有机酸等化学成分，有治疗高血压、抗血栓形成、抗氧化、神经保护、抗肿瘤等药理作用[5-7],其在临床上可用于治疗心血管疾病、眩晕症、肾脏疾病等[8-9]。高血压是危害人类健康的疾病之一，随着社会的发展，无论是老人或是小孩都有患高血压的几率，且患病的人数在逐渐增加[10]。课题组推测活血化瘀中药川芎或许能“扰动/抑制”高血压相关靶点网络而对高血压产生一定的治疗效果，但其成分、靶点与作用机制等尚不明确。本研究依靠网络药理学探讨川芎降血压的作用靶点与可能的作用机制，为其抗高血压的研究和临床应用提供一定的科学依据。

1 方法

1.1 川芎有效成分的筛选 川芎具有多成分、多靶点协同的作用，本研究采用TCMSP数据库进行川芎有效成分筛选，该数据库包括中国药典注册的499种中药，含29 384种成分，3 311个靶标和837个相关疾病，其特别的价值在于，它为每种化合物提供了药物药代动力学信息，如成药相似性(DL)，口服生物利用度(OB)，血脑屏障(BBB)，肠上皮通透性(Caco-2)等参数。一般类药性DL>0.18 、口服利用度OB>30%的分子具有较好的成药可能，本研究根据中药川芎的特性，设置DL>0.18, OB>30%，筛选其有效成分。

1.2 成分-靶点筛选 接下来通过已知的成分化合物，去寻找其可能作用的靶点。TCMSP数据库采用的是 HIT数据库预测算法SysDT 来获得药物靶点之间的关系。本研究首先利用TCMSP数据库筛选得到预测的分子靶点，同时保存分子的mol2结构文件；在Swiss-prot数据库里输入分子名得到预测的靶点，并保存分子3D结构的sdf格式；pharmmapper数据库应用潜在作用靶点反向预测，进行药效因匹配预测靶点并打分，Z’-score越大说明可能性越大，输入分子3D结构，提交并进行筛选得到分子的预测靶点。

1.3 疾病靶点收集 使用高血压“hypertension”为关键词在GeneCards(http://genecards.org)、CTD(http://ctdbase.org)、TTD(https://db.idblab.org/ttd)、OMIM(http://omim.org)数据库力查找疾病靶点。

1.4 有效成分-疾病靶点 将上述所得成分的作用靶点与疾病靶点导入cytoscape进行merge分析，得成分-疾病交集靶点。Cytoscape 软件源自美国系统生物学研究所，用于将生物分子交互网络与高通量基因表达数据和其他的分子状态信息整合在一起，其网络图包括节点(node)和边(edge)，每个节点可以是基因、miNRA或蛋白质等，节点与节点之间的连接 (edge) 代表着这些节点之间的相互作用。

1.5 蛋白相互作用(PPI)网络构建 研究蛋白之间的相互作用网络，有助于挖掘核心的调控基因。String是一个根据实验数据、从PubMed摘要中文本挖掘的结果和综合其他数据库数据等方法来研究蛋白相互作用的数据库。将得到的交集基因输入String中，以获取PPI网络图。

1.6 基因通路构建 将所得靶基因导入DAVID数据库，选择P值小于0.05，进一步运用DAVID数据库对网络预测出的靶点所涉及的基因功能Gene-Ontology (GO) 进行注释分析，并对相关通路(Pathway)进行KEGG 通路富集分析。

2 结果

2.1 主要成分信息 设置DL>0.18，筛选出川芎有效成分20个，再经文献查阅发现阿魏酸、川芎嗪、藁本内酯是治疗心血管疾病的有效成分，因此通过数据库筛选和文献查阅共得川芎有效成分23个。基本信息见表1。

表1 川芎有效成分

2.2 成分-靶点筛选与疾病基因收集 使用TCMSP、Swiss-prot、Pharmmapper三个数据库对川芎有效成分潜在的作用靶点进行筛选收集，然后使用Uniprot数据库将检索到的所有靶点蛋白校正为其官方名称(Officical Symbol)。共得到20个有效成分共167个作用靶点，其中3个成分没有有效靶点。使用高血压“hypertension”为关键词在数据库中查找，并将靶点名使用uniprot统一为基因名，共得到484个疾病靶点。

2.3 有效成分-疾病靶点 将以上所得成分的167个作用靶点与疾病484个靶点导入cytoscape进行merge分析，得到41个交集靶点，结果见图1。

图1 川芎治疗高血压的有效成分-疾病靶点网络

2.4 蛋白相互作用PPI网络分析 PPI网络所得结果如图2所示，将与高血压有关的41个靶蛋白进行PPI互作分析，得到最主要的靶蛋白，其中degree=22的血管内皮生长因子A(VEGFA)；degree=20的转录因子AP-1(JUN)；degree=19的信号转导和转录激活因子3(STAT3)、一氧化氮合酶(NOS3)、糖皮质激素受体(NR3C1)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2);degree=18的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、表皮生长因子受体(EGFR)；degree=17的原癌基因c-Fos(FOS)；degree=15的低氧诱导因子1-α(HIF1A)；degree=14的血红素加氧酶1(HMOX1)、雄激素受体(AR)；degree=12的凝血酶原(F2)、细胞色素P4503A4(CYP3A4)等节点度值大，在其中发挥了关键作用，提示川芎可通过调节以上生长因子、受体、酶、信号转导因子、激活因子、转录因子、诱导因子类关键靶蛋白，发挥治疗高血压的作用。

2.5 基因通路结果 将所得41个靶基因导入David数据库，选择P值小于0.05，基因通路构建所得GO结果见表2、KEGG结果见表3。

表3 KEGG信号通路

2.6 GO生物过程分析 如表2所示，将川芎治疗高血压发挥作用的41个靶基因进行GO生物过程富集，选择P<0.05的与高血压有关的GO生物过程，主要为：MAPK活性的正调控、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、平滑肌细胞增殖的正调控、细胞对激素刺激的反应、血管舒张的正调控、血压的负调节、细胞增殖的负调控、钙离子转运的负调控、血管生成的正调控、血管收缩的正向调节等。提示川芎可能通过调控MAPK信号通路表达、阻断血管收缩分子去氧肾上腺素等的生成、增加平滑肌细胞数量促进血管舒张、减少钙离子进入细胞、促进血管生成和正向调节血管收缩等生物过程治疗高血压疾病。

2.7 KEGG信号通路分析 将川芎的41个靶点基因在David进行KEGG信号通路富集分析，根据P<0.05筛选得到影响心血管类疾病高血压的相关信号通路15条，为了达到对基因进行注释和分类的目的，将筛选得到的通路用Omicshare数据库进行KEGG富集分析结果可视化，图3所示。并将筛选所得通路与靶点用cytoscape作靶点-通路图。分析筛选得到通路主要为：PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、钙信号通路、雌激素信号通路、抗胰岛素通路、VEGF信号通路、cGMP-PKG信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、多巴胺能神经突触、前列腺癌通路等。

图3 川芎治疗高血压疾病的相关通路富集图

3 讨论

高血压属于心血管疾病的常见疾病之一，严重威胁着人类的健康，其发病机制较为复杂。川芎辛散温通，功能活血祛瘀，作用广泛，适用于各种瘀血阻滞之病症。本研究利用网络药理学对川芎治疗高血压的作用机制进行了预测，通过TCMSP、Swiss-prot、Pharmmapper、genecard、ctd等数据库分别对成分靶点和疾病靶点进行筛选，并利用cytoscape软件进行靶点与靶点相交绘制，发现川芎与VEGFA、HMOX1、PPARG、NOS3、FOS、PTGS2、JUN、HIF1A、STAT3、F2、CYP3A4、AR、EGFR、NR3C1等41个与高血压相关的靶标蛋白相互作用，随后进行PPI互作分析得到节点度较高的核心靶点：血管内皮生长因子A(VEGFA)、转录因子AP-1(JUN)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、一氧化氮合酶(NOS3)、糖皮质激素受体(NR3C1)、前列腺素G/H合成酶2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)以及表皮生长因子受体(EGFR)和原癌基因c-Fos(FOS)。其中VEGFA在血管生成中起积极作用，诱导使血管通透性增加，VEGFA分泌水平升高会引起血管平滑肌(VSMCS)增殖水平的上升，参与高血压诱导的血管重建。高血压患者的微循环至大血管均有不同程度的血管内皮受损发生， VEGFA具有促进血管内皮增生、新生血管生成以及增加血管通透性的功能，血管内皮能够接受血液中的激素水平、压力水平、炎症介质等相关信号，这些信号的接受会使得血管内皮细胞分泌不同的生物活性物质用以调节血管内皮细胞功能，参与血管的收缩与舒张，进而调节局部血管功能的完整性[11]，从而控制血压。HMOX1在生理条件下活性最高的是脾脏，赵宁等[12]在研究中发现HMOX1基因的rs59607267位点与原发性高血压及血压水平相关。NOS3通过cGMP介导的信号转导途径参与血管平滑肌舒张，产生的NO介导血管内皮生长因子(VEGF)诱导冠状动脉血管生成，并通过激活血小板识别因子促进凝血，高鹏等[13]的研究发现NOS3基因14号内含子rs3918181多态性与高血压的发生相关，进一步证实了该基因与高血压发生的相关性。

通过KEGG通路分析，研究发现川芎主要通过HIF-1信号通路、钙信号通路、VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、cGMP-PKG信号通路、TNF信号通路、雌激素、胰岛素抵抗以及前列腺癌等通路的调控以治疗高血压疾病。

血管损伤是一个慢性、低度炎症反应的过程，它是高血压、动脉粥样硬化等多种心血管疾病发生和发展的始动环节及共同的病理学基础[14]。有研究表明TNF-α即肿瘤坏死因子-α在原发性高血压的发病机制中起重要作用，TNF-α不但参与机体的免疫防御功能，而且还是重要的炎症促进因子，可通过多种途径促进平滑肌细胞增殖，使平滑肌细胞内钙快速升高，引起血管收缩，进而导致血压升高[15]。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-2β两个亚基构成，HIF-1α 作为缺氧条件下的重要转录因子，调节血管的生成及细胞的凋亡和自噬，并参与调节多条信号通路。其中VEGF是受HIF-1直接调控的细胞生长因子，可通过与其特异性受体VEGFR结合激活酪氨酸蛋白激酶活性，促进新生血管的形成,提高血管通透性[16-17]。

PI3K/ Akt和其它一些下游通路可在压力负荷诱导高血压症中被激活[18]，PI3K/ Akt信号通路在调控细胞凋亡增殖的信号通路中发挥重要作用，通过激活Akt及其下游靶点p53等，促进细胞周期进展、增殖、生存和抗凋亡，从而影响血管内皮的细胞凋亡,此外雌激素涉及到P13K-Akt通路生成血管舒张因子NO、影响MAPK通路进而调节血压。

VEGF信号通路中VEGF因子是促血管新生作用最强的细胞因子, 不仅可以促进内皮细胞的增殖以及血管结构的形成，还能促进血流和血管通透性的改变。高血压导致心肌肥大，是心脏自身针对血流动力学因素改变，通过自分泌和旁分泌调节而发生的一种适应性改变，有研究发现肥大的心肌细胞VEGF表达增强[19]。

钙信号通路通过调节Ca2+通道，稳定血压，钙可以使外周血管阻力增加，从而导致血压升高，也有研究认为钙可以增加血管平滑肌细胞膜的稳定性，缓解精神紧张性血压升高，降低血管内源性加压素的反应，促进尿钠排泄，减少血容量，解除Na-K-ATP酶的活性抑制，增强钠和钾的主动转运，舒张血管平滑肌，降低血压[20]。

川芎除主要作用于上述通路以外，雌激素可降低血管通透性和血清胆固醇，松弛素作为胰岛素超家族的多肽激素之一，具有血管生成和舒张血管的作用，催产素能减少人体内肾上腺酮等压力激素的水平，以降低血压。

随着科学研究的不断深入，新的药物靶点以及降压药不断出现，使得高血压疾病的治疗得到更多的改善。此次研究结果初步阐释了川芎治疗高血压的作用机制，为开展探索川芎治疗高血压疾病相关的药效物质基础以及药理作用机制研究奠定了良好的基础。