心脏高表达基因ZNF425在肺癌中功能的探究

林 礼，揭雨婷，刘凤萍，王志宏，吴星瑶，张雨璐，邓璐瑶，刘 帆，肖梓淇，丁浩东，刘 超，范雄伟，袁婺洲

(湖南师范大学心脏发育研究中心，省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，动物多肽药物创制国家地方联合工程实验室，中国 长沙 410081)

就发病率(2018年全球有约210万新增肺癌患者，占癌症病例的11.6%，位居第一)和死亡率(每年约175.8万例死亡)而言，肺癌是全球最常见的癌症。事实上，肺癌也是癌症死亡的首要原因[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌病例的80%[2]。被诊断为非小细胞肺癌早期的患者，在经手术切除后的生存率相对较高[3]。但是，大多数患者在诊断时已经发展为晚期疾病，并且中位生存期从诊断之日起仅有18个月[4]。未经治疗的转移性非小细胞肺癌患者一年总生存率仅为10%，中位生存期为4～5个月。化学疗法显示了晚期NSCLC患者的生存率略有改善，可减轻症状并改善生活质量。实际上，从晚期疾病患者治疗过程中不同化学治疗剂与铂化合物联合治疗产生的治疗效果来看，不同的双重测试之间没有显著差异[5]。迄今为止，已有许多研究证明MAPK信号通路的过度激活会增加癌细胞的增殖和侵袭能力。同时，也有研究表明KRAB锌指蛋白与肺癌的发生息息相关。如：ZNF185的表达增加已参与肿瘤生长和转移的调节[6]及ZNF322A积极调节α-adducin(ADD1)和cyclin D1(CCND1)的转录，从而促进肺癌的致癌性[7]。

锌指(ZNF)基因家族是已知最大的基因家族之一,人类基因组中包含800多个编码功能蛋白、剪接变异体和伪基因的ZNF转录本[8,9]，它们可能参与发育、代谢、增殖和致癌等过程[10]。ZNF蛋白质包含多个ZNF域,通常组成集群的串联重复序列。尽管有20种不同类型的ZNF领域,最常见的是Cys2-His2(C2H2)类[11]，人类基因组中大约有700个基因含有C2H2结构[12]。当与DNA结合时， ZNF蛋白通过与KAP1 (KRAB相关蛋白1)的相互作用触发转录抑制，也称为TRIM28。TRIM28作为一种多分子实体的支架，该多分子实体包括异染色质蛋白1 (HP1)，H3K9me3特异性组蛋白甲基转移酶SETDB1和组蛋白去乙酰化复合物NuRD。这些蛋白通过触发异染色质的形成来共同抑制转录[10,13,14]。

笔者从人类心脏cDNA文库中克隆了一种新型的KRAB/C2H2型锌指基因ZNF425。它编码了一个包含752个氨基酸的锌指蛋白，其中包含一个保守的KRAB结构域，以及19个C2H2型锌指结构，且在物种间进化上高度保守。在前期研究中，已经发现ZNF425的mRNA主要存在于3个月大的人类胚胎中，而在其他阶段都无法检测到它的表达。通过构建EGFP-ZNF425融合蛋白，发现其主要定位于细胞核中，支持其转录调节蛋白的功能。同时荧光报告系统检测显示，ZNF425可以抑制SRE，AP-1和SRF的转录活性[15]。这些结果表明，ZNF425蛋白可能是MAPK信号通路的负调节因子，有介导细胞基因表达的功能。也有研究表明在急性T淋巴细胞白血病的Jurkat细胞系中瞬时过表达ZNF425时，能在不影响细胞周期的情况下抑制细胞的凋亡，并且出现ERK活性下降的现象[16]。这些研究都表明ZNF425与MAPK信号通路有着紧密的联系。

ZNF425也有可能参与了肺癌的调控，但是对其研究甚少。本文先利用生物信息学的方法研究ZNF425与肺癌的相关性，基于癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库、癌症和正常基因表达谱公共数据库(GEPIA)，将ZNF425与肺癌两种亚型LUAD(肺腺癌)和LUSC(肺鳞状细胞癌)的数据进行分析，然后利用人类肺癌样本IHC验证生物信息学的分析结果，最后构建ZNF425过表达质粒，在人类肺腺癌肺泡基底上皮细胞A549细胞系过表达ZNF425，考察A549细胞中JNK和P38的活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 A549细胞 A549细胞系从湖南师范大学生命科学学院心脏发育研究中心获得。

1.1.2 试剂 PRMI1640培养基、PBS(1×)、全式金生物有限公司的转染试剂TransIntroTMTransfectionELReagent；唯世尔生物科技有限公司的转染稀释液、回收胶纯化试剂盒；唯赞生物有限公司的T4-DNA连接酶；上海优宁维生物科技股份有限公司的β-actin抗体，JNK，p-JNK，P38及p-P38抗体试剂; Abcam生物有限公司的兔二抗。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 利用生物信息学相关网站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析癌症样本中基因表达情况；利用TCGA(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)查询NSCLC的相关资料;再利用Primerpremier5进行酶切位点分析及引物设计。

1.2.2 免疫组化 将前期使用支气管内超声引导针吸活检术(EBUS-TBNA)取得的不同时期的组织放入3%多聚甲醛中固定,置于高浓度蔗糖溶液中脱水后进行石蜡包埋,然后切片,利用ZNF425特异性抗体进行免疫组化染色。以癌旁组织作为对照，使用Image J软件进行定量分析，比较ZNF425蛋白水平变化情况。

1.2.3 pCMV-ZNF425-Tag2B过表达载体的构建 以ZNF425的ORF设计引物，经过PCR扩增得到目的基因片段，再进行纯化回收。回收产物与pCMV-Tag2B载体通过T4-DNA连接酶连接，连接产物在16 ℃下放置过夜，利用一般转化法筛选阳性单菌落，提取质粒利用双酶切验证，最后通过测序证实pCMV-ZNF425-Tag2B过表达载体构建成功。

1.2.4 Western Blot检测 按表1比例配置与目的蛋白合适浓度的蛋白胶。首先在蛋白电泳槽中加入适量电泳缓冲液，再依次加入蛋白样品及蛋白Marker。蛋白80 V恒压下离开浓缩胶后将电压增加至110 V继续跑样。跑胶结束后对比蛋白Marker切取所需蛋白转移到NC膜上，在电转膜仪中转膜20 min，让目的蛋白完全转移至NC膜上。

表1 SDS-PAGE 蛋白胶配方Tab. 1 SDS-PAGE albumin glue

将NC膜在室温下浸入30 mL 5%的脱脂牛奶中封闭2 h，封闭结束后用TBST液清洗。转移NC膜在4 ℃环境下过夜或室温下孵育一抗2 h(体积1∶1 000稀释)，完成后用TBST液清洗5～10 min，重复3次;转移NC膜在室温中孵育二抗2 h(体积1∶(3 000～5 000)稀释)，完成后用TBST清洗10 min，重复3次。利用显影仪显影， NC膜复苏二次显影，再利用蛋白印迹膜再生液室温下震荡孵育10 min，用TBST清洗10 min，重复3次，洗涤一抗-二抗复合物，孵育内参抗体。重复上述步骤，显影。

2 结果

2.1 ZNF425与肺癌相关性的生物信息学分析

基于癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库、癌症和正常基因表达谱分析的公共数据库(GEPIA)，将ZNF425在肺癌两种亚型LUAD(肺腺癌)和LUSC(肺鳞状细胞癌)中的数据，按照其生物信息分析模块构建分析路线图进行自动运算分析，据此得到多个样本中ZNF425在同一病患的癌旁组织和患病癌组织的差异表达，生成箱盒图、生存图等。首先分析肺癌中ZNF425基因表达差异性，并根据GEPIA生成的带有散点的盒形图来比较ZNF425在两种肺癌亚型的表达，选择TCGA正态进行差异分析和绘图。图1a是基于肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库的ZNF425mRNA在NSCLC中的表达。将59例LUAD患者组织(n=483)和50例LUSC患者组织(n=486)中ZNF425mRNA的表达与正常肺组织中ZNF425的表达进行比较，结果笔者发现与正常肺组织相比，癌组织中ZNF425的表达有所降低。

然后基于GEPIA数据库的病理分期数据具体分析ZNF425在肺癌不同时期的表达情况。GEPIA按照LUAD和LUSC癌症类型和病理分期绘制ZNF425基因的表达谱(如图1b)。可以发现ZNF425在肺癌Ⅲ期时表达略微下调。

最后基于GEPIA数据库生存数据，分析ZNF425在肺腺癌和肺鳞状细胞癌组织中的表达水平对患者生存周期的影响，绘制生存曲线发现，癌症确诊后的100个月内，高表达ZNF425的患者比低表达患者生存率高，这提示ZNF425的高表达可能对癌症有抑制作用(如图1c)。

(A)ZNF425在NSCLC中表达下调；(B)利用GEPIA工具绘出的肺癌病理分期不同阶段ZNF425的表达图谱；(C)采用GEPIA工具分析TCGA数据库中ZNF425表达水平的Kaplan-Meier总体生存(OS)曲线(n(low)=479, n(high)=480)图1 生物信息学分析(来源于TCGA和GEPIA数据库)Fig. 1 Bioinformatics analysis from TCGA and GEPIA database

2.2 ZNF425在人肺癌组织中的表达分析

首先对不同分型的病理标本进行石蜡包埋，切片。然后利用ZNF425特异性抗体进行免疫组化，将癌旁组织作为对照，分析癌症组织较癌旁组织中ZNF425的蛋白水平变化情况。发现癌症组织相比癌旁组织染色区域面积减小，染色程度也相对较淡(图2a)。最后使用Image J软件进行定量分析，发现ZNF425表达水平在3个时期都有所下调，且III期尤为显著(图2b)。这提示早中期肺癌的发生抑制了ZNF425的表达。

(a)不同病理分型的癌症组织及癌旁组织的ZNF425免疫组化(IHC)检测图(比例尺：200 μm);(b)定量分析，**P<0.01，ns无显著性。图2 ZNF425免疫组化(IHC)及量化图Fig. 2 ZNF425 immunohistochemical and quantitative images

2.3 ZNF425在肺癌中的功能与MAPK信号通路有关

上述结果说明ZNF425与肺癌早中期的发生具有相关性。本文利用广泛用于非小细胞肺癌的细胞水平研究的A549腺癌人类肺泡基底上皮细胞系，在其转入pCMV-ZNF425-Tag2B质粒和pCMV-Tag2B空载，48 h后收集细胞进行WB实验检测MAPK信号通路中关键调节因子JNK和P38的蛋白水平和磷酸化水平变化。结果显示在A549细胞中过表达ZNF425后，与空载相比，JNK和P38的蛋白水平变化不明显，而磷酸化水平都出现了下调的情况(图3)。

图3 过表达ZNF425影响MAPK信号通路Fig. 3 Overexpression of ZNF425 affected MAPK

3 讨论

KRAB-ZNF家族是高度复杂的，因为它包含了大量的同源基因、基因亚型和假基因，如此巨大的多样性阻碍了对这些蛋白质的详细分子特征分析。现在越来越多的研究报道表明KRAB-ZNF涉及了肿瘤生物学的多个方面。有学者利用TCGA项目中LUAD和LUSC数据集分析KRAB-ZNF基因表达模式与临床参数之间的关系，发现KRAB-ZNF基因的表达大多数具有显著差异性。且这些差异与肺癌的组织学分型、分子亚型和患者生存率有关[17]。这与本文的初步结果相符合：TCGA数据显示，ZNF425的表达在两种肺癌早中期都有所下调。同时数据显示，在癌症确诊后的100个月内，高表达ZNF425的患者比低表达患者生存率更高。这意味着ZNF425在肺癌的发展中具有一定功能，而且可能对肺癌早中期的发展起到抑制作用。对人类肺癌病理样本和癌旁组织样本经过ZNF425的免疫组化和定量分析后发现：与癌旁组织相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的肺癌组织中ZNF425蛋白水平都有下调的趋势，其中第Ⅲ期下调最为明显。这印证了生物信息学的结论。

在前期研究中，已经证明ZNF425可以抑制SRE，AP-1和SRF的转录活性，同时在白血病Jurkat细胞系中瞬时过表达ZNF425，使ERK活性下降并对Jurkat细胞产生影响。这些结论都表明ZNF425与MAPK信号通路紧密相关。同时MAPK信号通路在癌症的发生和治疗上有着举足轻重的地位。其中最著名的是RAS-MAPK信号轴(也称为RAS-RAF-MEK-ERK途径)，它在约40%的人类癌症中发生了变化，主要是由BRAF(约10%)及其上游激活因子RAS(约30%)的突变引起的，且上游调节子和下游效应子的突变也很普遍[18]。其次是JNK途径，有研究表明JNK途径常常在各种白血病和实体肿瘤包括皮肤、肺、结肠、脑及肝癌中过度活化[19,20]，这提示JNK是肿瘤启动子，也有研究证明JNK能增强癌症对ERK途径抑制剂和化学治疗药物的抵抗力[21]。最后是P38途径，活性氧(ROS)的产生能够激活P38，诱导癌细胞的死亡，但这仅限于癌症的起始阶段，一旦肿瘤形成，p38活性将支持其生长、转移和抵抗药物[22,23]。因此，本文在A549细胞系中瞬时过表达ZNF425后，通过WB检测MAPK信号通路中的JNK和P38这两个关键调节因子的磷酸化水平，发现这两个因子的活性都出现了不同程度的下调。由此可以确认，ZNF425蛋白在早中期肺癌的发展中具有一定功能，且很可能是通过抑制JNK和P38的过度活化从而抑制肺癌的生长、转移和对药物的抵抗。

随着对KRAB-ZNF蛋白研究的深入，发现其在生物体内具有重要作用。本文首次探究了ZNF425在肺癌中的功能，粗略地推测ZNF425蛋白可能具有通过抑制JNK和P38的过度活化从而抑制肺癌在早中期的生长、转移和对药物的抵抗的功能。其具体的作用机制还需进一步从临床收集更多的病理样本并进行药物耐受实验。相信对ZNF425的更深入了解能够转化为更好的肺癌治疗方案。