酱油沉淀控制酶解制备高起泡蛋白的研究

2020-08-14 07:44胡洋崔春
中国调味品 2020年8期
关键词:黄原水性水解

胡洋,崔春

(华南理工大学 食品科学与工程学院,广州 510640)

酱油是我国传统的发酵调味品,其含有丰富的氨基酸、糖类、有机酸、矿物质等成分,能够赋予菜肴鲜艳的色泽和鲜香的滋味,深受人们的喜爱[1,2]。酱油在加热灭菌过程中会产生一定量的沉淀,其主要成分是蛋白质。导致沉淀产生的原因可能有[3]:原料蛋白的不适度变性;发酵过程蛋白水解不完全;杂菌的污染;水解过程中生成不溶性的产物;酱油中蛋白胶体稳定性被破坏导致聚集等。酱油沉淀的产生不仅降低了原料的蛋白质利用率,而且难以与澄清的酱油有效分离。

良好的起泡性也是人们选购酱油的一项指标,摇晃酱油瓶时形成大小均匀且不易消散的泡沫被许多人认为是优质酱油的表现。酱油沉淀中含有丰富的蛋白质,采用蛋白酶法对酱油沉淀进行适度水解改性不仅能够制备具有良好起泡性和泡沫稳定性的起泡蛋白,还可以提高酱油沉淀蛋白的回收利用率,实现对酱油沉淀的高值化利用;而且将酱油沉淀酶解物应用于酱油中,可显著提高酱油品质。鉴于此,本试验研究了pH值、蛋白浓度、水解度对酱油沉淀蛋白控制酶解制备起泡蛋白的影响,并研究了黄原胶的添加对泡沫性质的改善效果,并从粘度、表面疏水性、ζ-电位等的变化的角度分析了不同因素及黄原胶添加对沉淀蛋白泡沫性质影响的机理。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

酱油沉淀:广东某酱油厂提供的加热灭菌后产生的酱油浑浊液;37071蛋白酶:诺维信(中国)生物技术有限公司;甲醛、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、黄原胶:分析纯,广州市丛源仪器有限公司。

1.1.2 主要设备

GL-21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;Scientz-18N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司;ME204E万分之一电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;FJ200-SH数显高速分散均质机 上海标准模型厂;XW-80A微型漩涡混合仪 沪西分析仪器厂;Synergy NEO2 HTS全功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;Zetasizer Nano ZS激光粒度分析仪 英国马尔文仪器有限公司;NDJ-8S型数显粘度计 上海精天电子仪器有限公司。

1.2 酱油沉淀蛋白的酶解

1.2.1 酱油沉淀的分离和收集

酱油浑浊液以60 ℃蒸馏水清洗2次,离心去除上清即得到不溶性的酱油沉淀,将沉淀真空冷冻干燥后备用。用凯氏定氮法测定蛋白含量为(32.589±0.142) g/100 g。

1.2.2 酶解工艺

将酱油沉淀以1∶4的料液比加水,在pH 10、37071蛋白酶添加量0.2%、温度45 ℃下水解1,3,6,9,12 h,酶解结束后调节pH至5.0,100 ℃灭酶15 min,离心去除残渣后即得到酱油沉淀蛋白酶解液。

1.3 酱油沉淀蛋白及不同水解度沉淀蛋白水解物的泡沫性质

1.3.1 pH值、蛋白浓度对酱油沉淀蛋白泡沫性质的影响

将酱油沉淀用蒸馏水配制成蛋白浓度为2%和4%的分散液,调pH至5,7,9,11,测定起泡性和泡沫稳定性。

1.3.2 pH值、蛋白浓度对不同水解度沉淀蛋白水解物泡沫性质的影响

不同时间酶解以获得不同水解度的沉淀蛋白水解物。将不同水解度的蛋白水解物用蒸馏水配制成蛋白浓度为2%和4%的分散液,调pH至5,7,9,测定起泡性和泡沫稳定性。

1.4 不同黄原胶添加量下沉淀蛋白水解物的泡沫性质

将酶解3 h和12 h的沉淀蛋白水解物用蒸馏水配制成蛋白浓度为4%的分散液,添加0.000%、0.025%、0.050%、0.075%、0.100%(W/V)的黄原胶,然后分别调pH至5和7,测定起泡性和泡沫稳定性。

1.5 指标测定

1.5.1 水解度DH的测定[4]

采用甲醛滴定法测定酱油沉淀蛋白酶解液中的氨态氮含量,采用凯氏定氮法测定酱油沉淀中的总氮含量,水解度计算公式如下:

水解度(%)=(酶解液中氨态氮含量/沉淀总氮含量)×100。

1.5.2 起泡性和泡沫稳定性的测定[5]

取10 mL一定浓度的蛋白分散液,用均质机以10000 r/min搅打1 min,记录0 min和30 min时泡沫和溶液的总高度V0和V30,试验重复3次,起泡性和泡沫稳定性的计算公式如下:

1.5.3 粘度测定

使用NDJ-8S数显粘度计测定样品的粘度。预实验使用不同的转子和转速组合确定大致的粘度范围,使扭矩百分比的数值在10%~100%内。

1.5.4 表面疏水性测定[6,7]

表面疏水性的测定采用ANS荧光探针法。用0.01 mol/L pH为5和7的磷酸盐缓冲液将测定样品稀释至蛋白浓度范围为0.05~10.8 mg/mL之间的6个浓度梯度。取稀释液2 mL,加入20 μL 8 mmol/L的ANS,振荡混匀后静置3 min,采用全功能酶标仪测定样品的荧光强度。仪器测定条件设置为:激发波长390 nm,发射波长470 nm,狭缝宽度5 nm。分别以蛋白浓度和荧光强度为横、纵坐标轴绘制曲线,曲线初始阶段的斜率即为蛋白质的表面疏水性指数。

1.5.5 ζ-电位测定

用0.01 mol/L pH 5和pH 7的磷酸盐缓冲液将测定样品稀释至蛋白浓度为5 mg/mL,取1 mL稀释液于样品池中,25 ℃下测定3次,结果以平均值呈现。

2 结果与分析

2.1 不同pH值、蛋白浓度对酱油沉淀蛋白泡沫性质的影响

由图1可知,随着pH值的增加,酱油沉淀蛋白的起泡性不断提高,但是泡沫稳定性呈现相反的变化趋势。良好的溶解度是蛋白质呈现良好起泡性的重要条件,等电点附近蛋白质溶解度较低,沉淀的蛋白较多,没有足够的蛋白吸附到界面,因此起泡性较差;当pH值逐渐偏离等电点时,蛋白质带电荷增加,由于静电排斥,不利于形成紧密的界面膜,导致泡沫稳定性降低[8]。

图1 不同pH值、蛋白浓度对酱油沉淀蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.1 Effects of pH values and protein concentration on the foaming property and foam stability of soy sauce precipitated protein

2.2 不同pH值、蛋白浓度对不同水解度沉淀蛋白水解物泡沫性质的影响

由图2可知,随着水解时间的延长,沉淀蛋白水解度不断增大,由初始的14.16%提高到27.05%。随着水解的进行,pH 5和pH 7下沉淀蛋白水解物的起泡性均呈现先上升后下降的趋势,且在水解3 h时达到最大值。李鸿健等[9]的研究也呈现相同的规律,适度的酶解可改善蛋白的起泡性,因为蛋白被水解形成多肽,更多的疏水区域暴露并且分子柔性增加;但是水解程度继续提高会使肽链越来越短,界面处形成的液膜越来越弱,又导致起泡性和泡沫稳定性下降。pH值对沉淀蛋白水解物起泡性影响的变化趋势与原始沉淀蛋白的相反,其在pH 5下最优。可能的原因是:对于沉淀蛋白水解物,蛋白的溶解度已经不是限制起泡性的因素,pH 5下水解物的溶解度高且此时分子间和界面处的排斥作用小,对起泡性更有利。研究蛋白浓度对泡沫性质的影响,结果显示:4%蛋白浓度下的起泡性和泡沫稳定性更高,因为蛋白浓度高,能够吸附到界面起作用的蛋白的量也更多。

图2 不同pH值、蛋白浓度对不同水解度沉淀蛋白水解物起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.2 Effects of pH values and protein concentration on the foaming property and foam stability of hydrolysates of soy sauce precipitated protein with different hydrolysis degrees

2.3 不同pH值、黄原胶添加量对沉淀蛋白水解物泡沫性质的影响

为了进一步改善酱油沉淀蛋白的泡沫性质,研究了接近酱油pH值(pH 5)和常规pH值(pH 7)下添加一定量的黄原胶对3 h(DH 25.23%)和12 h(DH 27.05%)水解物泡沫性质的影响。由图3可知,在pH 5和pH 7下,添加0.050%~0.100%的黄原胶对水解物的泡沫稳定性均有显著的改善效果,且pH 5下的改善效果更显著。在pH 5下,添加0.100%的黄原胶,3 h水解物的泡沫稳定性由43.55%提高到94.70%,12 h水解物的泡沫稳定性由44.44%提高到88.73%;在pH 7下,添加0.100%的黄原胶,3 h水解物的泡沫稳定性由42.96%提高到80.32%,12 h水解物的泡沫稳定性由33.75%提高到69.05%。对于3 h水解物,在pH 5下添加0.025%的黄原胶,泡沫稳定性就已经提高到了75.24%。当多糖添加量超过0.025%时,起泡性有一定程度的下降,这可能是因为发泡液粘度的增大阻碍了空气的混入。

图3 不同pH值、黄原胶添加量对3,12 h沉淀蛋白水解物起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.3 Effects of pH values and xanthan gum additive amount on the foaming property and foam stability of hydrolysates of soy sauce precipitated protein hydrolyzed for 3,12 h

2.4 不同pH下黄原胶添加量对3,12 h沉淀蛋白水解物分散液粘度的影响

由图4可知,蛋白水解物分散液的粘度仅与黄原胶的添加量有关,不同水解度(3 h和12 h水解)和不同pH值(pH 5和pH 7)对分散液粘度的影响不大。然而黄原胶对3 h和12 h水解物泡沫稳定性的改善效果不同,说明除了多糖添加增加的粘度,泡沫稳定性还与蛋白和多糖间存在的相互作用有关。Martinez等[10]也研究了不同添加量多糖对不同水解度向日葵蛋白泡沫性质的影响,他们认为添加多糖泡沫稳定性的提高与本体粘度和界面蛋白-多糖相互作用导致的薄膜弹性增加有关。

图4 不同pH下黄原胶添加量对3,12 h沉淀蛋白水解物分散液粘度的影响Fig.4 Effects of xanthan gum additive amount on the viscosity of hydrolysates of soy sauce precipitated protein hydrolyzed for 3, 12 h at different pH values

2.5 不同pH下水解时间及添加0.05%黄原胶对沉淀蛋白水解物表面疏水性的影响

不同pH下水解时间及添加0.50%黄原胶对沉淀蛋白水解物表面疏水性的影响见图5。

图5 不同pH下水解时间及添加0.05%黄原胶对沉淀蛋白水解物表面疏水性的影响Fig.5 Effects of enzymolysis time and adding 0.05% xanthan gum on the surface hydrophobicity of hydrolysates of soy sauce precipitated protein at different pH values

许多研究表明,蛋白质的表面疏水性对其泡沫性质具有重要意义,表面疏水性增加,能够促进蛋白质吸附至界面,降低表面张力,改善起泡性。pH 5下整体的表面疏水性高于pH 7下,这可能是pH 5下水解物起泡性和泡沫稳定性更佳的一个原因。酱油沉淀蛋白水解物的表面疏水性随着水解度的增加而不断增大。因为酶改性使蛋白被逐步水解为肽段,使得蛋白质内部的疏水基团暴露,表面疏水性增加。沉淀蛋白在水解3 h时获得了最高的起泡性,这也说明了表面疏水性不是影响起泡性的唯一因素,酶解后蛋白的带电荷和粒径的变化等情况也影响着起泡性。添加0.05%黄原胶的水解物分散液表面疏水性更低,这可能是多糖的粘附覆盖了一些疏水基团。

2.6 不同pH下添加0.05%黄原胶对3,12 h沉淀蛋白水解物ζ-电位的影响

ζ-电位能够衡量颗粒间相互吸引或排斥作用力的强度,它的数值与分散体系的稳定性相关[11]。分子间需要适当的斥力,如果斥力过大会影响颗粒吸附到界面从而影响表面性质,但斥力过小会引起分子间发生聚集[12]。由表1可知,ζ-电位数值均为负值,颗粒均带负电。pH 7下整体的带电荷量高于pH 5下的,3 h和12 h水解物的带电荷量差异不大。添加0.05%黄原胶的样品电位更高,因为黄原胶是一种阴离子多糖,与蛋白的结合使电位变大。ζ-电位对于泡沫性质的影响应该结合蛋白质的结构来看,如果蛋白质水解后结构变化有利于界面吸附,那么ζ-电位的降低就有利于泡沫稳定性。

表1 不同pH下添加0.05%黄原胶对3,12 h沉淀蛋白水解物ζ-电位的影响Table 1 Effects of adding 0.05% xanthan gum on Zeta potential of hydrolysates of soy sauce precipitated protein hydrolyzed for 3, 12 h at different pH values

3 结论

酱油沉淀蛋白的起泡性随着pH值的升高不断增加,但泡沫稳定性呈现相反的变化趋势。在4%蛋白浓度下,pH 5时沉淀蛋白的起泡性和泡沫稳定性分别为24.02%和43.75%,pH 11时的起泡性和泡沫稳定性分别为43.46%和15.80%。

为了改善酱油沉淀蛋白的泡沫性质及实现酱油沉淀的高值化利用,采用37071蛋白酶进行适度水解。随着水解时间的延长,水解度不断增加,研究发现水解3 h时的起泡性和泡沫稳定性达到最高。pH值对沉淀蛋白水解物泡沫性质的影响与原始沉淀蛋白的相反,其在pH 5下最优,3 h蛋白水解物的起泡性和泡沫稳定性分别达到59.00%和43.55%。

添加黄原胶以改善沉淀蛋白水解物的泡沫性质,当黄原胶添加量为0.05%~0.1%时,均能显著提高3 h和12 h沉淀蛋白水解物的泡沫稳定性,但是添加量过大会因为体系粘度的增加影响起泡性。在pH 5下,添加0.05%的黄原胶,3 h水解物的起泡性和泡沫稳定性分别达到54.00%和81.81%。

本试验还从粘度、表面疏水性、ζ-电位等的变化的角度分析了pH值、水解度、黄原胶添加对沉淀蛋白水解物泡沫性质影响的机理,这些指标对于研究蛋白的表面性质都具有重要的意义,需要综合起来进行分析。

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