miR-144在人牙周膜成纤维细胞中调控Toll样受体2及骨唾液酸蛋白的表达

魏 蓉，张 源，李新月

牙周炎是一种发生于牙齿支持组织、病因复杂的慢性感染性疾病，在其始动因子牙菌斑生物膜作用下激活机体免疫炎症反应，最终导致牙周组织破坏，其表现之一便是牙槽骨吸收，是成年人失牙的主要原因[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是P.gingivalis的毒力因子之一[2]，并与牙槽骨吸收密切相关[3]。LPS除直接破坏牙周支持组织外，还可引发宿主免疫炎症反应，激活机体免疫应答机制[4]。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)作为固有免疫应答的重要防线，在牙周炎发生发展中起到了重要的防御作用[5]。LPS可作为TLRs的配体与其结合后在牙周炎中发挥重要作用[6]。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是一种高度糖基化、磷酸化的糖蛋白，能够在骨细胞外基质沉积，并能促进羟基磷灰石成核，对于成骨细胞分化、骨基质矿化都具有重要意义，并且在骨、牙骨质、牙本质的初始矿化中具有潜在作用[7]。LPS能够在hPDLFs中引起BSP下调，与牙槽骨代谢息息相关[8]。

miRNA是一组广泛存在于真核生物体内的单链非编码RNA，长度约22个核苷酸，通过完全或不完全的碱基互补配对原则，与特定mRNA的3′UTR或5′UTR结合后降解mRNA或抑制其翻译进而抑制蛋白表达，在转录后水平调控基因的表达[9]。它能够参与调控免应答反应[10-11]，在牙周炎中也起到了重要的调控作用[12]。因此，本研究筛选TLR2具有负性调控关系的miRNA，进而研究LPS介导下hPDLFs中miRNA与TLR2及miRNA与BSP的作用关系，初步探究miRNA在牙周炎骨代谢过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

DMEM培养基(GIBCO BRL，美国)、胰蛋白酶(GIBCO BRL，美国)、胎牛血清(GIBCOBRL，美国)、Trizol试剂(Invitrogen，美国)、M-MLV逆转录酶(Takara，日本)、RNA酶抑制剂(Takara，日本)、dNTP(10 mmol/L)(Takara，日本)、SYBRPremix ExTaq试剂盒(TaKaRa, 日本)、CG-02/05实时荧光定量PCR仪(HealForce,中国)、正常熔点/低熔点的琼脂糖凝胶(GIBCO，美国)、CO2恒温培养箱(Thermo Forma，美国)、超净工作台(苏州净化设备有限公司)、P.gingivalisLPS(InvivoGene,美国)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix forqPCR(+gDNAwiper)(诺唯赞生物，中国)、DYCP-31BM型水平电泳装置(北京市六一仪器厂)、LabWorksTM凝胶成像及分析系统(UVP, 美国)、TS-1型摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 目标miRNA的筛选 用生物信息学技术筛选与TLR2具有靶向结合关系的miRNA：用TargetScan、MiRanda、PicTar4、RNAhybrid数据库查找和筛选TLR2基因(物种为人)的3′UTR序列，并结合已报道文献中通过luciferase检测证明与TLR2具有靶向作用位点并具有负性调控关系的miRNA作为研究对象，得到miR-23a、miR-144、miR-19a作为目标miRNA[13-16]。

1.2.2 hPDLFs的培养及处理 取因正畸拔除的前磨牙(已通过天津市口腔医院伦理审查)根中1/3牙周膜组织剪碎成 1 mm3小组织块，移植至24孔板，用含 10% FBS、1%双抗的 DMEM 培养液，置 37 ℃含 5% CO2的细胞培养箱中进行原代培养。待hPDLFs完全融合后按1∶3比例传代。待第3代细胞贴壁后，用PBS漂洗1次，换为矿化诱导培养基继续培养(矿化诱导培养基：去酚红 DMEM，10%FBS，1×10-8mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 μg/mL抗坏血酸)，使其骨向分化，隔3 d换1次培养液，长满后传代。接种至6孔板，待90%融合后更换不含血清的矿化诱导培养基继续培养12 h，用无血清DMEM配置的浓度为10 mg/LP.gingivalisLPS处理培养8 h后，收集细胞。

1.2.3 hPDLFs中miRNA及TLR2的mRNA表达水平检测 用Trizol试剂按其说明分别提取各组hPDLFs中的总RNA 1 μL，按M-MLV逆转录酶及HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)要求逆转录制备cDNA(逆转录序列见表1)及扩增，以U6为内参，引物序列由天津赛尔生物技术有限公司设计(引物序列见表2)，实时荧光定量法测定miRNA的mRNA表达水平，同时测定TLR2的mRNA表达水平(以β-actin为内参)。反应条件为94 ℃ 4 min, 94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 40个循环。用相对定量公式2-ΔΔCt(分别计算待测基因与内参的Ct平均值，两者之差为ΔCt，实验组与对照组之间为ΔΔCt)对结果进行检测，同样的实验重复3次。选择与TLR2呈负性表达关系的miR-144作为进一步研究对象。

表1 制备cDNA的RT序列

表2 荧光定量PCR引物序列

1.2.4 hPDLFs的转染 按1.2.2继续培养hPDLFs，转染前1 d用含有10%FBS的 DMEM矿化诱导培养液终止消化并吹打混匀细胞，将细胞接种至6孔板中，置 37 ℃含 5%CO2的细胞培养箱中培养 18～24 h，使次日转染时细胞达到 70%～80%板底面积。分别用无血清培养基3 μL稀释(1)空白对照组、(2)阴性对照组(LPS组)、(3)miRNA过表达对照组(LPS+miRNA-144 mimics control组)、(4)miRNA过表达组(LPS+miR-144 mimics组)、(5)miRNA抑制对照组(LPS+miRNA-144 ASO NC组)、(6)miRNA抑制组(LPS+miR-144 ASO组)，终量50 μL，分别加入50 μL脂质体Lipofectamine 2000混匀制成转染液，加入对应孔中，100 μL/孔。每孔滴加300 μL Opti-MEM,常规培养4 h后每孔换为10%FBS矿化诱导培养液3 mL，继续培养。转染后48 h，将(2)～(6)共5组hPDLFs加入用无血清 DMEM配制的终浓度为 10 mg/LP.gingivalisLPS刺激8 h，空白对照组(1)更换为不含血清的矿化诱导培养基继续培养8 h，收集细胞，提取 RNA和裂蛋白。

1.2.5 Real-time PCR法检测BSP及TLR2的mRNA表达水平 各组样本细胞长满后用Trizol试剂提取总RNA，实时荧光定量法测定TLR2及BSP的mRNA表达水平，实验方法同1.2.3。

1.2.6 Western Blot检测BSP及TLR2的蛋白表达水平 收集1.2.4中各组样本提取总蛋白，各组取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移蛋白至PADF膜上形成印迹，室温下脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃下与一抗结合摇床过夜，浸洗后与二抗结合1.5 h浸洗显影，曝光显影并进行定影处理。胶片用LabWorksTM凝胶成像及分析系统进行摄像，分析各组蛋白条带的亮度值，与对应GAPDH(内参照)条带亮度值相比，得到校正后的各组蛋白的条带亮度值，实验重复3次取平均值，并绘制柱状图。

1.3 统计学方法

使用SPSS 20.0对所有数据进行统计学分析，数据均以均值±标准差表示。两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05，以P<0.05表示有统计学差异。绘图由Graphpad Prism 7.0软件完成。

2 结 果

2.1 hPDLFs体外培养

牙周膜组织块接种后3～6 d可见细胞游离出来，但尚不能分辨细胞结构；接种20 d后，可见大量成纤维细胞向四周呈放射状生长；传代后细胞呈放射状或旋涡状生长，形态与原代相同：镜下呈长梭形，胞体丰满，胞质均匀，细胞透明度大，细胞核圆形或卵圆形，核仁清晰(图1)。

图1 第4代hPDLFs(倒置显微镜 ×40)

2.2 P.gingivalis LPS上调hPDLFs中TLR2的表达水平

实时荧光定量PCR检测结果显示，hPDLFs经10 mg/LP.gingivalisLPS刺激8 h后，TLR2的mRNA表达水平明显上调约13.6倍，且其上调水平与正常组相比具有显著的统计学差异(P=0.000，图2)。

实时荧光定量PCR法检测TLR2的mRNA表达水平，与对照组相比，*：P<0.05

2.3 目标miRNA在正常及LPS诱导hPDLFs中的表达

实时荧光定量PCR显示，正常hPDLFs中有miR-19a、miR-23a、miR-144表达，10 mg/L LPS刺激hPDLFs 8 h后，miR-19a、miR-23a表达水平上调，其中miR-19a上调约2.6倍，miR-23上调约1.8倍；而miR-144表达水平下调约6/100。其中上调的miR-19a、下调的miR-144与正常组对照均具有统计学差异(P=0.002，P=0.000，图3)。选择表达水平下调的miR-144作为进一步研究对象。

实时荧光定量PCR法检测miRNA的mRNA表达水平，与对照组相比，*：P<0.05

2.4 miR-144对hPDLFs在LPS诱导下TLR2表达水平的影响

miRNA-144 过表达对照组、miR-144过表达组、miR-144抑制对照组、miR-144抑制组分别体外转染矿化诱导的hPDLFs，并经10 mg/L LPS诱导8 h，与空白对照组和单纯LPS刺激组比较TRL2的mRNA及蛋白表达水平，PCR结果显示：与空白对照组相比，10 mg/L LPS诱导能明显激活hPDLFs中TLR2的表达(P=0.007)；miR-144过表达组TLR2的mRNA表达水平明显低于miR-144过表达对照组(P=0.002)和阴性对照组(P=0.007)，过表达miR-144明显降低LPS对TLR2 mRNA表达的激活作用；miR-144抑制组TLR2的mRNA表达水平明显高于抑制miR-144组(P=0.012)和阴性对照组(P=0.017)，miR-144明显上调TLR2的mRNA表达水平，与LPS具有协同作用(图4A)。Western Blot结果显示：过表达miR-144可以降低LPS诱导的TLR2的蛋白表达水平，抑制miR-144可以进一步升高LPS诱导的TLR2的蛋白表达水平(图4B)；每组对应蛋白条带见图4C。

A：实时荧光定量PCR检测TLR2的mRNA表达水平；B：WesternBlot检测TLR2的蛋白表达水平；*：P<0.05；C：分别对应图4B分组的蛋白条带

2.5 miR-144对hPDLFs在LPS诱导下BSP表达水平的影响

miRNA-144过表达对照组、miR-144过表达组、miR-144抑制对照组、miR-144抑制组分别体外转染矿化诱导的hPDLFs，并经10 mg/L LPS诱导8 h，与空白对照组和阴性对照组比较BSP的mRNA及蛋白表达水平，PCR结果显示：与空白对照组相比，10 mg/L LPS能明显下调hPDLFs中BSP的mRNA表达(P=0.016)；miR-144过表达组BSP的mRNA表达水平明显高于miR-144过表达对照组(P=0.022)和LPS组(P=0.018)，miR-144明显抵消LPS对BSPmRNA表达的抑制作用；miR-144抑制组BSP的mRNA表达水平明显低于miR-144抑制对照组(P=0.005)和LPS组(P=0.021)，抑制miR-144明显下调BSP的mRNA表达水平，与LPS具有协同作用(图5A)。Western Blot结果显示：过表达miR-144可以上调LPS抑制BSP蛋白表达，抑制miR-144可以进一步下调LPS抑制BSP蛋白表达(图5B)；每组对应蛋白条带见图5C。

A：为实时荧光定量PCR检测BSP的mRNA表达水平；B：为Western Blot检测BSP的蛋白表达水平；与对照组相比，*：P<0.05；与阴性对照组(单纯LPS刺激)相比，*：P<0.05；C：为分别对应图5B分组的蛋白条带

3 讨 论

牙周炎会引起牙周软组织炎症、牙槽骨吸收，研究发现在炎性牙周组织中TLR2高表达并在牙周炎发生发展中发挥了重要作用。研究发现，相较于健康人群，牙周炎患者牙龈组织中TLR2高表达[17]。革兰阴性菌感染时，其主要抗原成分LPS可与细胞表面受体TLR2/4结合，通过转导外界刺激激活细胞内信号通路，造成牙周组织的破坏[18]，TLR2作为LPS的关键受体，同时作为固有免疫应答的重要组成部分，在其中发挥了重要作用。在P.gingivalisLPS诱导的巨噬细胞牙周炎模型中也发现TLR2表达水平升高[19]。我们的研究发现hPDLFs经LPS刺激后，TLR2同样被激活，与以往研究结果一致。P.gingivalisLPS可以通过TLR2促进IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10[20-22]等促炎因子释放。此外，LPS还能通过TLR2影响牙槽骨吸收，P.gingivalisLPS可通过TLR2引起骨代谢的重要角色——NF-κB配体激活受体(receptor of activator of NF-κB ligand，RANKL)表达变化介导牙槽骨吸收[23]。

牙周炎相关miRNA研究发现miRNA在炎性及健康牙周组织中异常表达[24]，且能影响下游炎性因子的表达并参与调控牙槽骨代谢[25-26]。我们通过生物信息学技术及文献检索发现miR-144与TLR2间具有靶向结合位点，且有研究证明在大鼠模型中TLR2与miR-144二者呈负性作用关系[14]。因此本研究筛选miR-144为研究对象，发现LPS刺激hPDLFs后，TLR2表达水平升高的同时miR-144表达水平降低。但是另有研究发现，相较于正常组织，miR-144在牙周炎性组织中呈高表达[27-28]，与本研究结果存在差异。分析此差异的原因，可能是在牙周炎环境中作为机体自我保护反应性高表达miR-144，在miR-144上游或许存在更为复杂的调控机制，而非单纯LPS刺激hPDLFs的细胞模型的单一环境。本研究亦发现miR-144在hPDLFs中抑制TLR2表达水平，能够部分抵消LPS对TLR2的激活作用，从而证明了miR-144与TLR2的负向作用关系。

牙周炎相关研究发现BSP在保持正常的牙周组织功能、牙槽骨重建中具有重要作用[29]。有研究发现，LPS刺激人牙周膜成纤维细胞后BSP的基因表达水平下调，其成骨能力被削弱[30]。在我们的前期研究中取得类似结果，发现在hPDLFs中LPS对BSP的下调作用是通过TLR2及信号通路介导实现的[8]。在本研究中发现，miR-144在抑制TLR2表达的同时上调BSP的表达，抵消LPS对BSP的抑制作用。进一步证明在LPS诱导的牙周炎中，miR-144具有与TLR2的负向作用，且促进了成骨蛋白BSP的表达。miRNA对BSP的调控作用的研究目前少有报道，其作用机制也尚不明了。因此miR-144对BSP的调控是否是通过TLR2介导的这一作用机制尚需进一步研究。

综上，本研究证明了在hPDLFs中，miR-144能够负性调控TLR2并与BSP表达呈正相关性，与LPS具有反向作用，在抑制牙周炎症反应、促进成骨方面可能具有积极作用，能够为牙周炎骨代谢的基因学治疗提供研究思路和实验依据，为其今后的临床应用奠定基础。