一株长白山野生桦褐孔菌菌株的分离及菌丝生长特性研究

王丽莹，王欢，王淑敏，陈长宝，张岳，唐敏

（长春中医药大学，吉林 长春130117）

桦褐孔菌〔Inonotus obliquus（Ach.ex Pers.）Pilát〕，学名斜生纤孔菌，属担子菌门，锈革孔菌科，褐卧孔菌属（纤孔菌属）真菌[1]，夏秋季生于白桦、银桦、榆树和赤杨等活立木或倒木上，又称为白桦茸、茶卡（h）、Birch mushroom等[2]。主要分布于俄罗斯、中国、日本、波兰和荷兰等国家，成为俄罗斯著名的抗肿瘤药物。关禹桦褐孔菌研究较为广泛，证实其含有多糖、三萜类、甾体、多酚等多种有效成分，具有抗糖尿病、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、降血脂、提高免疫力、保肝等多种生物活性及药理作用[3-7]。

野生桦褐孔菌其生长十分缓慢，而人工栽培技术尚不成熟，加之大规模的采集导致野生匮乏，价格昂贵，且质量参差不齐[8-10]，桦褐孔菌的利用受到极大的限制。因此，利用现代发酵技术获得大量菌丝体，具有生产周期短，成本低，发酵物有效成分含量稳定、可控等优点[11]。固体或液体发酵技术可快速、大量获得质量均一且稳定的发酵产物，为进一步开发利用提供广阔的空间，但不同菌株之间菌丝活力差异较大，次级代谢产物多变，因此对野生菌株的生物学特性研究具有重要意义。本研究对一株采自长白山的野生桦褐孔菌纯菌株的生长特性进行研究，以菌丝生物量为考察指标，优化桦褐孔菌的最适培养基配方和培养条件，为后续液体和固体发酵工艺及对发酵产物的质量评价等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桦褐孔菌采自长白山，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为多孔菌科，褐卧孔菌属，桦褐孔菌（Inonotus obliquus），菌株编号：CCUCM-IO001，保存于吉林生菌物药生物技术工程实验室。

1.2 仪器与试剂

AUY220分析天平（岛津国际贸易上海有限公司）；TGL16高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；LDZX-50KBS高压灭菌器（上海申安医疗器械厂）；超净工作台（苏州净化设备厂）；pH B-5便携式pH计（上海伟业仪器厂）；303AB-2恒温培养箱（上海申光仪器仪表有限公司）。

蔗糖、葡萄糖（北京化工厂）；琼脂粉、乳糖、CaO、木糖、MgSO4、CaCO3、(NH4)2SO4（天津市光复精细化工研究所）；蛋白胨、酵母粉（北京奥博星生物技术有限公司）；脲（广东汕头市西陇化工厂）；NH4NO3（天津市福晨化学试剂厂）；KH2PO4（西拢化工股份有限公司）；VB1（广东华南药业集团有限公司）；豆饼粉、麦麸、玉米粉（安徽农家有机食品）等。

1.3 试验方法

1.3.1 桦褐孔菌纯培养菌株的分离纯化桦褐孔菌菌核表面消毒，切取菌核内部约0.5 cm3的小块，迅速接种到PDA培养基中（马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然），置于28℃的恒温培养箱中培养，观察菌丝的萌发和长势。选取菌丝粗壮浓密、无杂菌污染的菌落，接种于PDA培养基中，置于28℃的恒温培养箱中继续传代培养，分离出纯菌株，并进行菌丝形态观察和分子生物学鉴定。

1.3.2 单因素试验

1.3.2 .1不同碳源对菌丝生长的影响在基础培养基配方（马铃薯20%，KH2SO4 0.15%，MgSO4 0.1%，琼脂2%，pH自然）上，分别添加不同碳源，制成不同碳源培养基（C0：基础培养基；C1：基础培养基+蔗糖2%；C2：基础培养基+麦芽糖2%；C3：基础培养基+玉米面浸出液4%；C4：基础培养基+葡萄糖2%；C5：基础培养基+木糖2%；C6：基础培养基+乳糖2%），接种菌丝后，置于28℃的恒温培养箱中进行培养。

1.3.2 .2不同氮源对菌丝生长的影响在基础培养基配方（马铃薯20%，蔗糖2%，KH2SO4 0.15%，MgSO4 0.1%，琼脂2%，pH自然）上，分别添加不同氮源，制成不同氮源培养基（N0：基础培养基；N1：基础培养基+蛋白胨2%；N2：基础培养基+硝酸铵0.2%；N3：基础培养基+硫酸铵0.2%；N4：基础培养+基麦麸汁4%；N5：基础培养基+豆饼粉2%；N6：基础培养基+酵母粉2%；N7：基础培养基+尿素0.2%），接种菌丝后置于28℃的恒温培养箱中进行培养。

1.3.2 .3不同微量元素对菌丝生长的影响基础培养基配方（马铃薯20%，蔗糖2%，蛋白胨2%，琼脂2%，pH自然）上，分别添加不同微量元素（W0：基础培养基；W1：基础培养基+MgSO4 0.1%+KH2PO4 0.15%；W2：基础培养基+KH2PO4 0.15%；W3：基础培养基+NaH2PO4 0.15%；W4：基础培养基+MgSO4 0.15%；W5：基础培养基+VB10.05%；W6：基础培养基+CaO 0.1%），置于28℃的恒温培养箱中进行培养。

1.3.3 正交试验基础培养基配方（马铃薯20%，琼脂2%，pH自然），根据单因素试验结果，按L9（34）设计优化培养基配方，正交因子水平设计见表1。

表1正交试验因素水平Table 1 Factor and level of the orthogonal test %

1.3.4 不同pH对菌丝生长的影响将基础培养基（马铃薯汁20%、蔗糖1%、蛋白胨1%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.10%、琼脂2%）pH值分别调整为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，分别接种菌丝，置于28℃的恒温培养箱中进行培养。

1.3.5 不同温度对菌丝生长的影响在基础培养基（马铃薯20%、蔗糖1%、蛋白胨1%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.10%、琼脂2%、pH自然）上接种接种菌丝，分别置于温度为15、20、25、30℃恒温培养箱中进行培养。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同碳源对桦褐孔菌菌丝生长的影响由表2可知，桦褐孔菌在6种碳源上均能生长，但乳糖不宜作为碳源，菌丝生长极其缓慢，蔗糖作为碳源，菌丝生长速度最快，且菌丝生长势良好，麦芽糖次之，而其他4种碳源菌丝生长速度相差不大。

表2不同碳源对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 2 Effects of different carbon sources on the mycelial growth of

表2不同碳源对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 2 Effects of different carbon sources on the mycelial growth of

碳源Carbon source菌丝形态Mycelial morphology生长势Growth potential菌落边缘Colony edge霉菌污染Mould contamination生长速度（cm2/d）Growth rate C0 粗、菌落厚度一般thick,generally thick colony C1 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony C2 粗、菌落薄thick,thin colony C3 粗、菌落薄thick,thin colony C4 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony C5 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony C6 细、菌落薄thin,thin colony旺盛strong较旺盛relatively strong一般general一般general旺盛strong旺盛strong不旺盛lack of growth整齐neat较整齐relatively neat整齐neat整齐neat较整齐relatively neat整齐neat整齐neat无污染non-pollution 0.723无污染non-pollution 1.003无污染non-pollution 0.874无污染non-pollution 0.797无污染non-pollution 0.767无污染non-pollution 0.712无污染non-pollution 0.179

2.1.2 不同氮源对桦褐孔菌菌丝生长的影响由表3可知，桦褐孔菌在7种氮源上均能生长，各组菌丝生长速度表现为：N1＞N2＞N3＞N0＞N4＞N5＞N6＞N7。蛋白胨、硝酸铵作为氮源，菌丝生长速度快，且菌丝生长势良好，可作为其生长的良好氮源。但尿素组菌丝生长极其缓慢，不宜作为氮源。

表3不同氮源对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 3 Effects of different nitrogen sources on the mycelial growth of

表3不同氮源对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 3 Effects of different nitrogen sources on the mycelial growth of

氮源Nitrogen source菌丝形态Mycelial morphology生长势Growth potential菌落边缘Colony edge霉菌污染Mould contamination生长速度（cm2/d）Growth rate N0 粗、菌落薄thick,thin colony N1 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony N2 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony N3 粗、菌落一般thick,generally thick colony N4 细、菌落薄thin,thin colony N5 细、菌落薄thin,thin colony N6 粗、菌落较薄thin,relatively thin colony N7 细、菌落薄thin,thin colony旺盛strong较旺盛relatively strong较旺盛relatively strong旺盛strong一般general一般general一般general不旺盛lack of growth较整齐relatively neat较整齐relatively neat较整齐relatively neat较整齐relatively neat较整齐relatively neat较整齐relatively neat较整齐relatively neat整齐neat无污染non-pollution 1.066无污染non-pollution 1.119无污染non-pollution 1.118无污染non-pollution 1.071无污染non-pollution 1.049无污染non-pollution 0.870无污染non-pollution 0.665无污染non-pollution 0.117

2.1.3不同微量元素对桦褐孔菌菌丝生长的影响由表4可知，6种微量元素添加后，桦褐孔菌除在添加0.1% CaO菌丝不能生长外，添加其他微量元素均能生长，各组微量元素菌丝生长速度表现为：W1＞W2＞W3＞W0＞W4＞W5。其中，0.1%MgSO4+0.15%KH2PO4作为微量元素，菌丝生长速度快，且菌丝生长势最好。

表4不同微量元素对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 4 Effects of different microelements on the mycelial growth of

表4不同微量元素对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 4 Effects of different microelements on the mycelial growth of

微量元素Microelement生长速度（cm2/d）Growth rate W0 粗、菌落厚thick,thick colony菌丝形态Mycelial morphology生长势Growth potential菌落边缘Colony edge霉菌污染Mould contamination旺盛strong整齐neat无污染non-pollution 0.918 W1 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony W2 粗、菌落一般thick,generally thick colony W3 粗、菌落厚thick,thick colony W4 粗、菌落厚thick,thick colony W5 粗、菌落薄thick,thin colony W6 基本不生长grow poorly较旺盛relatively strong旺盛strong旺盛strong旺盛strong旺盛strong不旺盛lack of growth整齐neat整齐neat整齐neat整齐neat整齐neat整齐neat无污染non-pollution 1.167无污染non-pollution 1.021无污染non-pollution 1.002无污染non-pollution 0.925无污染non-pollution 0.800无污染non-pollution 0.000

2.2 正交试验

由表5、6可知，4个考察因子中对菌丝生长影响最大的为蔗糖，其次为MgSO4，再次为蛋白胨，影响最小的为KH2PO4。最佳培养基配方为蔗糖1%、蛋白胨1%、MgSO40.15%、KH2PO40.10%。由于正交试验7培养基配方比例与方差分析得到的培养基配方比例不同，所以对这2种不同配方比例的培养基进行验证，结果为蔗糖1%、蛋白胨1%、MgSO4 0.1%、KH2PO4 0.15%菌丝生长情况较好。

表5正交试验结果Table 5 Orthogonal test results

表6方差分析Table 6 Analysis of various

2.3 不同pH对桦褐孔菌菌丝生长的影响

由表7可知，桦褐孔菌菌丝在pH值为4.5~7.5均可生长，其菌丝生长速率表现为：pH值为6.5＞7＞4.5＞6.0＞5.0＞7.5＞5.5，因此,其最适宜pH值为6.5，表明该菌株适于在弱酸性至中性环境中生长。

表7 pH对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 7 Effects of pH on the mycelial growth of

表7 pH对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 7 Effects of pH on the mycelial growth of

pH 菌丝形态Mycelial morphology生长势Growth potential菌落边缘Colony edge霉菌污染Mould contamination生长速度（cm2/d）Growth rate 4.5 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony 5.0 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony 5.5 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony 6.0 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony 6.5 较粗、菌落较厚relatively thick,relatively thick colony 7.0 粗、菌落厚thick,thick colony 7.5 细、菌落薄thin,thin colony较旺盛relatively strong 整齐neat 无污染non-pollution 1.128较旺盛relatively strong 整齐neat 无污染non-pollution 1.102旺盛strong 整齐neat 无污染non-pollution 0.783较旺盛relatively strong 整齐neat 无污染non-pollution 1.126较旺盛relatively strong 整齐neat 无污染non-pollution 1.232一般general 整齐neat 无污染non-pollution 1.192一般general 整齐neat 无污染non-pollution 0.876

2.4 不同温度对桦褐孔菌菌丝生长的影响

由表8可知，温度对菌丝生长影响较大，桦褐孔菌菌丝在15~30℃均可生长，但不适合在15~20℃下培养，菌丝体生长较慢，最适生长温度为30℃，菌丝生长速度最快，菌丝长势最强。

表8不同温度对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 8 Effects of different temperatures on the mycelial growth of

表8不同温度对桦褐孔菌菌丝生长的影响Table 8 Effects of different temperatures on the mycelial growth of

温度（℃）Temperature 菌丝形态Mycelial morphology生长情况Growth situation生长势Growth potential菌落边缘Colony edge霉菌污染Mould contamination生长速度（cm2/d）Growth rate 15 细、菌落薄thin,thin colony 20 较细、菌落厚relatively thin,thick colony 25 较粗、菌落厚relatively thick,thick colony 30 较粗、菌落厚relatively thick,thick colony不旺盛lack of growth旺盛strong较旺盛relatively strong较旺盛relatively strong整齐neat整齐neat整齐neat整齐neat无污染non-pollution 0.46无污染non-pollution 0.57无污染non-pollution 1.33无污染non-pollution 2.01

3 结论与讨论

桦褐孔菌子实体呈瘤状，通常是以菌核形式生长于桦树皮下或活立木的树皮下或倒木上[12]，由于桦褐孔菌具有显著的抗糖尿病和抗肿瘤活性而受到多个国家科研工作者的欢迎，在俄罗斯、日本和中国被广泛使用。由于其生长周期极长、资源稀缺等多种因素，难以大量获得桦褐孔菌子实体，且价格昂贵。因此，应用发酵微生物技术获得桦褐孔菌发酵产物，以菌丝体、发酵液代替子实体，能快速获得其发酵产物，不仅便于对发酵产物的质量控制和药理活性方面的研究，同时具有生产周期短、易获得和成本低等特点，在食品和药品行业的应用具有巨大的潜力。

由于不同桦褐孔菌菌株生长特性不同，故本研究对采自长白山的一株野生桦褐孔菌进行分离纯化，得到纯培养菌株CCUCM-IO001，并对菌丝生长特性进行了系统的研究，通过单因素试验和正交试验，优化了其菌丝体培养基配方为蔗糖1%、蛋白胨1%、MgSO4 0.1%、KH2PO4 0.15%，温度30℃，pH 6.5，此条件下菌丝的生长情况最好，为以后优化桦褐孔菌液体和固体发酵培养，规模化、标准化生产提供一定指导，为后续发酵产物的药理活性研究，功能食品的开发奠定基础。而其发酵产物与子实体的活性成分含量差异，相关药理活性比较研究仍需进一步深入研究。