基于SSR分子标记的集安白桃等桃资源遗传多样性分析

舒楠，石广丽，张庆田，刘涛，路文鹏※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春130112；2.山东省果树研究所，山东 泰安271000；3.集安市人参特产业发展中心，吉林 集安134200）

桃（Prunus persica L）属于蔷薇科桃属，起源于中国西部，主要分布于欧洲、亚洲、美洲、非洲以及澳洲。桃种质资源丰富，种植范围广，适应性强[1]。目前，桃作为世界上栽培范围最广的多年生落叶果树之一，已遍布世界各地，位居核果类果树之首[2]。研究表明，目前我国搜集保存的桃种质资源达2 000多份[3]，了解不同资源的遗传背景是对其利用的前提及基础[4]。集安市白桃生长于中朝边境、鸭绿江畔，该地区具有独特的气候条件，使得白桃成为当地风味浓郁的特色水果。集安白桃果皮薄且易剥离，果皮具绒毛，果肉呈乳黄色，果核为紫红色，肉质软嫩多汁，酸甜适口，风味独特。其果实含有多种营养成分，其铁的含量相当于苹果和梨的4~6倍。集安地区白桃资源丰富，不同资源间果实质量差异较大，最大的达229.5 g，而最小的只有58.1 g。目前已筛选出优异的白桃品种‘集福’，但其遗传背景尚不清楚。桃不同资源可按照品种类群、生态群及形态学等进行分类，但部分品种（系）很难根据形态特征进行区分，而形态学的标记位点少且受环境因素影响大[5]，所以，利用分子标记技术对桃进行遗传分析具有重要意义。

SSR（simple sequence repeat，SSR）又称微卫星标记，因其重复性好，多态性丰富，稳定性高，检测方便及具有共显性等特点，目前已成为育种工作中重要的遗传标记方法之一[6]，且已在苹果[7]、葡萄[8]、桃[9]和李[10]等多种果树中得到应用。Verde等[11]于2013年对桃不同器官进行了转录组测序，并在NCBI上传80 797条表达序列标签（expressed sequence tag，EST）序列，这为搜索桃SSR分子标记提供了大量的数据资源。Bouhadida等[12]利用15对SSR分子标记成功鉴别了94份桃资源。张佳俊等[13]选取18对SSR引物对‘保佳红’的亲缘关系进行分析，结果表明，‘保佳红’与‘大久保’的亲缘关系最近。廖安红等[14]采用12条ISSR引物对71份资源进行了聚类分析，结果表明，贵州桃具有丰富的遗传多样性。本研究利用SSR分子标记技术对吉林省集安市的白桃桃资源及山东省农业科学院的桃资源进行遗传多样性分析，以期为后续抗寒桃资源的选育及综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取15份桃资源，其中包括吉林省集安市的6份白桃资源及山东省农业科学院的9份桃资源，详细信息见表1。

表1 15份桃种质资源信息Table 1 Information of 15 accessions of peach

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取与检测2018年11月采集枝条，并于实验室水插发芽，用液氮将幼嫩叶片速冻，于﹣80℃冰箱保存。试验中所有桃资源的基因组DNA均采用改良的CTAB法提取[15]，DNA质量及浓度的检测利用1%琼脂糖凝胶电泳，对于检测结果不合格的样品需重新提取至符合试验需求为止。

1.2.2 SSR扩增选取参考文献[1,4,16]中引物共48对作为试验所用SSR引物，从中筛选多态性引物24对用于样品的遗传多样性分析。PRC扩增体系为20.0L，其中，包括DNA模板（20~30 ng/L）1.0L，Taq DNA聚合酶0.8L（2.5 U/L），10 buffer 2.0L，正、反向引物各0.8L，dNTP（0.25 mol/L）0.5L，14.1L无菌去离子水。反应程序参考凌士鹏等[1]的方法。扩增产物利用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，最后利用银染染色。试验所用所有试剂均购于长春晶美有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 测定结果统计方法

电泳检测结果中，每条带均代表1个分子标记，即1个引物结合位点，数据统计时则按照条带的有无来统计，有条带的位置计作1，无带计作0，以此类推。

1.4 数据分析

采用二元数据进行多态性位点百分数的计算，利用NTSYS软件分析数据，按照Jaccard公式计算不同种质资源间的相似系数（genetic similarity，GS），并利用软件的UPGMA方法进行聚类分析，构建聚类分析图。

2 结果与分析

2.1 引物的多态性分析

试验共选取48对引物，从中筛选条带清晰及多态性丰富的引物24对用于遗传多样性分析。扩增结果表明，单对引物能够扩增出5~30条带，平均每对引物19.6条。电泳结果（图1）显示，24对引物共扩增出471条带，所有片段大小均在50~300 bp，多态性条带为100%。因此，SSR分子标记技术检测桃不同资源的遗传多样性效率高，稳定性强，同时也说明桃不同资源间具有丰富的遗传多样性。

2.2 15份不同桃资源的遗传相似系数及聚类分析

基于SSR分析的15份桃资源的遗传相似系数见表2。由表2可知，15份桃资源的遗传相似系数在0.400~0.889，平均遗传相似系数为0.645。试验中所用的6份集安白桃的遗传相似系数在0.633~0.889，与山东省农业科学院的9份桃资源的遗传相似系数在0.414~0.721，其中，LLT与ZST02的遗相似系数最大，为0.889，表明二者遗传组成最为接近。

图1 AJ826975引物对15份桃资源扩增结果电泳图Fig.1 Primer AJ826975 amplification results of 15 Prunus accessions

15份不同桃资源的聚类分析结果见图2，可以分为三大类。第1类共包括‘川中岛’‘福岛桃王’‘苍方早生’‘超红’‘中农金华’‘瑞光33’和‘莱山蜜’共7份资源，当遗传相似系数为0.787时，‘超红’和‘中农金华’聚为一类，当遗传相似系数为0.688时，‘川中岛’与‘福岛桃王’‘苍方早生’‘超红’‘中农金华’‘瑞光33’和‘莱山蜜’聚为一类；第2类共包括‘蜜冬雪’‘LLT’‘ZST01’‘MT’‘ZST02’‘LNT’和‘集福’共7份资源，其中‘LLT’和‘ZST02’均为采自吉林省集安的2个白桃株系，这2份资源的亲缘关系也最近，猜测2份资源可能存在亲本与子代的关系；第3类为‘珲春桃’，‘珲春桃’为白桃的一个品系，原产地位于吉林省珲春市。从聚类分析结果可以看出，来自不同地区的资源大部分聚为一类，说明其亲缘关系相对较近，同时也说明SSR标记在桃遗传分析上的可靠性及稳定性。

表2基于SSR分析的15份桃资源遗传相似系数HunchuntaoTable 2 Genetic similarity coefficient of 15 accessions of by SSR

表2基于SSR分析的15份桃资源遗传相似系数HunchuntaoTable 2 Genetic similarity coefficient of 15 accessions of by SSR

桃资源Peach resources集福Jifu LNT ZST02 MT ZST01 LLT珲春桃Hun chun tao莱山蜜Lai shan mi蜜冬雪Mi dong xue瑞光33 Rui guang 33中农金华Zhong nong jin hua川中岛Chuan zhong dao集福Jifu 1.000 LNT 0.746 1.000 ZST02 0.714 0.772 1.000 MT 0.690 0.678 0.679 1.000 ZST01 0.700 0.787 0.793 0.633 1.000 LLT 0.786 0.772 0.889 0.679 0.793 1.000珲春桃Hunchuntao 0.630 0.655 0.577 0.556 0.643 0.615 1.000莱山蜜Laishanmi 0.525 0.645 0.610 0.590 0.603 0.542 0.561 1.000蜜冬雪Midongxue 0.642 0.667 0.627 0.604 0.582 0.667 0.531 0.536 1.000瑞光33Ruiguang 33 0.533 0.525 0.448 0.567 0.581 0.414 0.643 0.762 0.400 1.000中农金华Zhongnongjinhua 0.610 0.633 0.526 0.576 0.656 0.526 0.582 0.645 0.519 0.754 1.000超红Chaohong 0.633 0.721 0.655 0.567 0.710 0.621 0.571 0.635 0.655 0.548 0.787 1.000仓方早生Cangfangzaosheng 0.508 0.600 0.491 0.576 0.623 0.491 0.545 0.742 0.444 0.754 0.667 0.689 1.000福岛桃王Fudaotaowang 0.590 0.677 0.576 0.656 0.762 0.576 0.596 0.750 0.500 0.762 0.677 0.698 0.774 1.000川中岛Chuanzhongdao 0.645 0.667 0.567 0.581 0.688 0.600 0.621 0.738 0.526 0.719 0.730 0.688 0.762 0.738 1.000超红Chao hong仓方早生Cang fang zao sheng福岛桃王Fu dao tao wang

图2基于SSR结果的15份桃资源聚类分析Fig.2 Clustering analysis of 15 varieties based on SSR results

3 讨论

SSR分子标记技术是继RAPD后基于PCR反应的标记技术之一，且重复性优于RAPD[17]。目前，SSR分子标记技术已成功用于桃的遗传分析及品种的鉴定[9,16,18-20]。Aranzana等[20]利用16对SSR引物成功将212个桃品种的87%区分开，其余的具有相同指纹图谱的品种包括桃的突变体及来自于同一个亲本的不同自带个体。Badenes等[21]对西班牙不同类型的桃品种进行鉴定，结果表明，仅利用10对SSR引物即可将几乎所有的品种区分开。本研究所选用的24对SSR引物能够将15份资源全部区分开，且所有引物扩增出的条带均为多态性条带，表明SSR标记的高效性。对不同白桃资源进行遗传多样性分析结果显示，在遗传相似系数0.595处，所有采自于集安的白桃聚在一类，表明这些资源的亲缘关系相对较近，桃种群的形成与其发源地的气候条件密切相关，生态条件及地理因素是影响物种分化的最直接因素。15份桃资源遗传多样性鉴定结果与各资源的地理起源和系谱相一致，同时也说明了SSR标记是进行桃遗传多样性分析的一种效率高、稳定性强的技术手段。