Box-Behnken响应面法优化黄柏盐酸小檗碱的提取工艺

胡玲玲

(安康学院 化学化工学院， 陕西 安康 725000)

黄柏(Cortexphellodendri )是由芸香科黄檗属落叶乔木黄檗或黄皮树(PhellodendronchinenseSchneid)的干燥树皮制成。是我国传统的中药材之一，药用价值很高，生用性寒苦，能清热解毒，治疗热毒疮疡等[1-3]，也可经炮制使用。现代药理学研究表明，黄柏具有与黄连相似的抗病原微生物作用[4]，其提取物中含有多种生物碱，如小檗碱、黄柏碱、巴马亭、药根碱、木兰花碱等。这些生物碱有降压利胆、抗溃疡、镇静等作用[5-7]。盐酸小檗碱是黄柏提取物中的主要有效成分之一，具有广谱的抗菌活性。黄柏小檗碱的传统提取方法有石灰乳法、酸水法和醇提法等。近年来发展的酶辅助法和超声辅助法[ 8-10]避免了高温引起的药物活性成分结构的变化，且具有省时、节能的特点。试验采用响应面分析法[11-14]，研究超声辅助提取不同因素对提取率的影响，优化超声辅助法提取黄柏小檗碱的工艺，提高其提取率，以期为黄柏的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材 黄柏：购自于安康市药材公司。

1.1.2 试剂 无水乙醇(AR) ，天津市天力化学试剂有限公司； 盐酸小檗碱对照品，上海源叶生物科技有限公司；浓盐酸(AR)， 天津市东丽区新中村； 去离子水，实验室自制。

1.1.3 仪器 L5S紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；KQ2200E型超声波清洗仪(40 kHz，250 w)，昆山市超声仪器有限公司；中草药粉碎机(FW177型)， 天津市泰斯特仪器有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅，上海科伟永兴仪器有限公司；FD-1A-80台式冷冻干燥机，上海予腾生物科技有限公司； 电子分析天平(AE224)，舜宇恒平仪器。

1.2 方法

1.2.1 盐酸小檗碱标准曲线的绘制 用电子分析天平(AE224)称取盐酸小檗碱对照品20 mg，加热溶解，容量瓶中定容至100 mL，配制成0.2 mg/mL的盐酸小檗碱的储备液。用吸量管分别吸取储备液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL于25 mL的容量瓶中，用去离子水定容，制成系列浓度的盐酸小檗碱对照品溶液。用去离子水做空白对照，用紫外分光光度计扫描波长，345 nm处有最大吸光度。故在波长345 nm处测定对照品溶液的吸光度[15-16]。分别以吸光度和盐酸小檗碱浓度为纵坐标和横坐标，得到回归方程y=0.009 6x+0.184 4 ；R2=0.999 2。盐酸小檗碱浓度在4～40 μg/mL线性关系良好。

1.2.2 盐酸小檗碱的提取和提取率的计算 将黄柏用中药粉碎机粉碎，过16目筛，精密称取黄柏粉末5 g于具塞锥形瓶，加入一定量的提取溶剂，浸泡24 h，设定提取的超声温度和超声时间。提取液趁热抽滤，旋转蒸发至粘稠状态后转移至100 mL的容量瓶中用去离子水定容，吸量管吸取1 mL溶液并稀释至100 mL，在波长345 nm处分别测其吸光度并计算盐酸小檗碱的提取率。

式中，C为盐酸小檗碱浓度(μg/mL)；V为浓缩液定容体积；n为稀释倍数；m为黄柏粉末的质量(g)。

1.2.3 单因素试验

1) 超声时间。以HCl-70%乙醇(1∶100)为提取溶剂，液料比30∶1(mL∶g，下同)，超声温度60℃，分别超声提取20 min、30 min、40 min、50 min和60 min，取其滤液，定容稀释、测定吸光度并计算盐酸小檗碱的提取率。

2) 超声温度。以HCl-70%乙醇(1∶100)为提取溶剂，液料比30∶1，分别在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃的条件下超声提取50 min，取其滤液，定容稀释、测定吸光度并计算盐酸小檗碱的提取率。

3) 乙醇浓度。液料比30∶1， 超声温度60℃，超声提取时间50 min,分别以HCl-50%乙醇、HCl-60%乙醇、HCl-70%乙醇、HCl-80%乙醇及HCl-90%乙醇(1∶100)为提取溶剂进行超声处理，取其滤液，定容稀释、测定吸光度并计算盐酸小檗碱的提取率。

4) 液料比。用HCl-70%乙醇(1∶100)为溶剂，液料比分别为10∶1、20∶1，30∶1、40∶1、50∶1，超声温度60℃，超声提取50 min，取其滤液，定容稀释、测定吸光度并计算盐酸小檗碱的提取率。

1.2.4 响应面试验 在单因素试验的基础上，筛选出影响盐酸小檗碱提取较显著的3个因素采用Design-Expert 8.0.6，结合Box-Benhnken的中心试验原理，进行响应面试验。其因素水平见表1。

表1 黄柏盐酸小檗碱提取的响应面因素及水平

1.3 数据分析

采用Design Expert8.0.6对数据进行处理及分析，建立回归方程。

2 结果与分析

2.1 不同因素对黄柏盐酸小檗碱提取率的影响

从图1可知不同超声时间、超声温度、料液比及乙醇浓度条件下黄柏盐酸小檗碱的提取率。

2.1.1 超声时间 黄柏盐酸小檗碱的提取率随超声时间延长呈上升趋势，在50～60 min虽为增长趋势，但增幅降低。提取率趋于平稳，可能是因为超声时间增长使得破壁更碎，杂质析出更多，与小檗碱竞争溶于提取液，使得盐酸小檗碱的提取率增幅减缓。故选择超声提取时间为40 min。

2.1.2 超声温度 随着温度的升高，黄柏盐酸小檗碱的提取率也快速上升。60℃时，提取率最大，为6.68%。随着温度的继续上升提取率呈下降趋势。这可能是因为随着温度的升高，盐酸小檗碱的结构在超声条件下，随着温度的提高受到了破坏，表现出提取率下降。故选择超声提取的温度为60℃。

2.1.3 液料比 随加入提取溶剂量的增多，黄柏盐酸小檗碱的提取率呈先升后降趋势。在30∶1时提取率最大，为6.46%。故选择液料比为30∶1。

2.1.4 乙醇浓度 随提取液乙醇浓度的增大，黄柏盐酸小檗碱的提取率呈先升后降趋势，当溶剂中乙醇浓度为70%时，黄柏盐酸小檗碱提取率最大，为6.38%。推测可能是盐酸小檗碱的极性与70%的乙醇的极性相似，所以溶解度最大。故选择提取溶剂的乙醇浓度为70%。

2.2 响应面试验优化黄柏盐酸小檗碱提取工艺

2.2.1 回归模型的建立 从表2可知不同处理的黄柏小檗碱提取率。对数据进行拟合分析得线性回归方程模型：Y=6.75+0.064A-0.047B+0.23C-0.19AB+0.020AC-0.0075BC-0.55A2-0.30B2-0.76C2。方差分析表明，该回归模型P<0.000 1，该模型极显著；且失拟值项中P=0.611 4，不显著；R2=0.995 7，RAdj2=0.990 3，表明该模型可靠。方差分析表明，超声时间P=0.014 9(<0.05)，料液比P<0.0001。各因素对提取率的影响依次为C(液料比)>A(超声时间)>B(超声温度)。

表2 响应面试验各处理的黄柏盐酸小檗碱提取率

2.2.2 不同因素的交互作用 从图2可知，液料比和超声时间的响应曲面较陡，表明液料比和超声时间对黄柏盐酸小檗碱提取率的影响显著；超声温度和料液比的曲面相对较平缓，说明超声温度和料液比对提取率的影响不显著，与方差分析结果一致。超声时间和超声温度的等高线呈明显的椭圆形，响应面曲线较陡，表明超声时间和超声温度间的交互作用较强，且方差分析结果中，交互项AB的P=0.000 3(<0.01)，也说明超声时间和超声温度因素间存在显著的交互作用。液料比与超声时间，液料比与超声温度的等高线不呈明显的椭圆形，表明交互作用不明显，与方差分析结果一致(AC项和BC项P>0.05)。

2.2.3 最佳提取条件的确定 根据Box-Behnken试验设计所得的结果和回归方程，预测超声波辅助提取黄柏盐酸小檗碱的最优工艺为超声时间40.77 min，超声温度58.95℃，液料比为31.54∶1(mL∶g)，该条件下，预测黄柏盐酸小檗碱的提取率为6.77%；考虑到实际操作，将最佳提取工艺修正为超声时间40 min，超声温度59℃，液料比30∶1(mL∶g)，经3次平行测试，黄柏盐酸小檗碱的提取率为6.73%，与预测值的相对误差为0.59%，说明，该工艺可靠。

3 小结

以HCL-70%乙醇(1∶100)为溶剂，对超声辅助提取黄柏盐酸小檗碱的工艺优化结果表明，最佳提取工艺为超声时间40 min，超声温度59℃，液料比为30∶1(mL∶g)，在该条件下，黄柏盐酸小檗碱的提取率较高，为6.73%。