帚枝千屈菜白粉病的病原鉴定

任毓忠，李 妍，方治豪，海 艳，王凯涛

（石河子大学农学院，新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室，新疆石河子832003）

帚枝千屈菜（Lythrum virgatumLinn.）为千屈菜科（Lythraceae）宿根多年生湿生小灌木类植物，别称水柳[1]。它具有耐盐碱、耐旱、耐寒等特性，对生长环境的适应性很强。另外，帚枝千屈菜秀丽整齐的高大株丛、淡雅美丽的花色、较长的花期和观赏时间、简单的养护管理方法以及净化水体的优良功效，在全国各地的河岸沿线、湿地及湖边都可作为景观植物栽植。在城市园林设计中，常常用作镶嵌于林地边缘的花镜或道路边的绿化隔离带[2]，也可栽植于城市景观河边，发挥其进化水体的城市生态卫士功能。其全草还可入药[3]。石河子市也大量从外地引种和栽植帚枝千屈菜，主要作为花镜和水体保护应用于城市景观。关于帚枝千屈菜病害的报道并不多见，白粉病主要危害其叶片、茎秆和花梗等部位，以白色粉状物覆盖叶片，使叶片失绿甚至干枯死亡，导致植株早衰，花期缩短，严重影响其观赏价值。南斯拉夫和我国内蒙古都已报道了千屈菜（L.salicaria）白粉病的发生和危害，依据病菌的形态特征，将病原确定为千屈菜白粉病菌Erysiphe lythri[4-5]，但并未记录病菌是否可以感染千屈菜属的其他种类，包括小灌木类的帚枝千屈菜（E.lythri）。

本研究拟通过田间调查、病菌形态观察和rD-NA-ITS 区序列分析，明确石河子帚枝千屈菜白粉病的危害现状及病原菌种类，为帚枝千屈菜白粉病的防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 病样的采集

2018 年7 月上旬帚枝千屈菜白粉病在石河子市初始发生，在病害发生较普遍的市区景观河公园内，每隔7～10 d，采集白粉病症状明显的新鲜叶片或茎秆，用自封袋带回石河子大学农学院实验室，用于病菌的形态观察和鉴定，直到9 月上旬结束。

1.2 田间症状观察

从7 月上旬开始，每隔7～10 d 定点观察田间白粉病的发生扩展情况，记录病害的症状表现，以及病菌有性时代闭囊壳的出现时间等。

1.3 病原形态特征观察

将采集的新鲜白粉病样本带回实验室后，用透明胶带粘贴病组织上的新鲜病斑，然后将胶带粘贴面向下，小心放置在滴加蒸馏水的载玻片表面，如果气泡太多，可在水中添加少量的洗衣粉（1%）。用光学显微镜（MOTIC BA300）观察和记录描述病菌的形态特征，并测量病菌各个营养体和繁殖体的大小，主要包括外生菌丝、附着胞的形状、分生孢子梗的特征和大小、分生孢子的着生方式及形态大小；闭囊壳的颜色、形态大小，闭囊壳上附属丝的形态、附属丝数量；闭囊壳内含有的子囊数、子囊的形态、大小，单个子囊内子囊孢子数、孢子特征形态和大小等[6-7]。将观察记录的病菌特征结果，参考白粉菌系统分类鉴定方法[8-12]，明确引起石河子帚枝千屈菜白粉病的病原分类地位。

1.4 病原分子鉴定

1.4.1 基因组DNA 的提取和PCR 扩增 在白粉病发生高峰期，采集新鲜的白粉病症状明显的叶片带回室内，用干净的毛笔刷取叶片表面的白粉层，收集大约0.5 g 病菌样品，用真菌基因组DNA 提取试剂盒（BioFlux 公司），依据说明书的步骤提取白粉菌基因组DNA。PCR 扩增采用真菌rDNA-ITS 区通用引物为ITS1/ITS4，引物交上海生工生物工程有限公司合成，序列分别为ITS1（5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′）[7]。PCR 扩增程序参照 MORI 等[9]的方法进行，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测目标片段。

1.4.2 病菌rDNA-ITS 区序列的分析 将电泳检测后的病菌rDNA-ITS 区扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果进行拼接、校正后，在 GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库上传测序结果，并进行核酸序列BLAST 比对和分析，比对结果用于病菌rDNA-ITS 区的序列同源性分析和鉴定；同时查阅千屈菜（Lythrum）白粉病的相关资料和已登录的序列，同时查阅和下载白粉菌属（Erysiphe）相近种的rDNA-ITS 区序列，采用DNAMAN 8.0 软件分析序列的同源性，MEGA 7.0 软件用邻近距离法构建系统进化树[13-15]。

2 结果与分析

2.1 病害症状

观察发现，在石河子市，帚枝千屈菜白粉病从7 月初开始，病菌以感染叶片为主，茎秆、叶柄、花穗轴、萼片和托叶也可感染，花瓣一般不感染。发病初期，植株下部叶片正面先出现零星白色的小霉斑，后逐渐扩展至上部叶片；发病严重时，叶片正反面都覆盖有白色粉状物，叶片形成褐色到红褐色的失绿小斑点，随后整个叶片颜色变深，呈黄褐色到红褐色，质地变硬变脆，植株早衰（图1-A）。主茎、花穗轴以及叶柄感病一般先从幼嫩部位开始，表面先出现不规则的白色霉斑，进一步扩展后，上部茎秆和穗轴均覆盖有白色粉状物，后期茎秆颜色变褐（图1-B、C）。托叶和萼片症状与叶片相似，严重时除花瓣外的全部花序组织密布白色粉层，造成花蕾大部分脱落或花朵提早凋萎，花期大大缩短或观赏品质降低（图1-C）；8 月中旬后，叶片正面的病斑上形成初期黄色、后变黑色的颗粒状小点，即白粉菌的闭囊壳，闭囊壳在病斑表面多散生，少聚生（图1-D）。

2.2 病原的形态特征

病菌经光学显微观察，帚枝千屈菜白粉病菌的菌丝体外生，无色透明，菌丝直径为5.7 μm（4.1～7.6 μm），附着胞多单生，少数对生，呈乳突状或裂瓣状（图2-A）；分生孢子梗直立，由1～4 个细胞组成，长度为 52.9 μm（26.3～78.9 μm），脚胞直或弯曲，圆柱状；上单生1 个分生孢子（图2-B），分生孢子单细胞，无色透明，多为短棒状，少数桶形或椭圆，大小为 33.4 μm（27.2～43.4 μm）×17.2 μm（14.0～21.6 μm），表面无纤维状体（图 2-C）；分生孢子萌发只产生1 个芽管，芽管从孢子的单侧顶端伸出（图2-D）。

病菌的闭囊壳初为黄色，成熟后变为褐色至黑色，多数散生，少聚生，扁球形或球形，直径为98.7 μm（90.5～112.3 μm），壁细胞呈不规则的多边形；附属丝长菌丝状，13～23 根，顶端无分枝，弯曲或部分呈曲折状，附属丝0～6 个分隔，长度为66～700 μm，是闭囊壳直径的 0.6～7 倍（图 2-E）；成熟的附属丝全长褐色，或基部细胞颜色较深，顶端细胞无色透明；闭囊壳内着生有3～7 个子囊（图2-F）；子囊近圆形或卵圆形，无柄或少数短柄，子囊大小为（53.4～65.6）μm×（35.4～54.8）μm；子囊内有3～6 个子囊孢子，子囊孢子单胞无色，椭圆形至球形，大小为（17.3～28.2）μm×（12.3～18.3）μm（图2-G）。

根据以上所观察的石河子帚枝千屈菜白粉病病原的形态特征，与BRANISLAV 等[4]和刘铁志等[5]描述的千屈菜白粉菌（E. lythri）特征表现一致，因此，初步将石河子帚枝千屈菜白粉病的病原鉴定为千屈菜白粉菌（Erysiphe lythri）。

2.3 rDNA-ITS 区序列的测定和分析

对石河子市帚枝千屈菜白粉病菌株SHZLV01 rDNA-ITS 区进行PCR 扩增，获得的目标片段大小为639 bp，将目标片段的序列在NCBI 核酸数据库中进行 BLAST 比对（登录号：MK779057），扩增序列与GenBank 中已登录的中国千屈菜（Lythrum salicaria）白粉菌Erysiphe lythri（登录号：MG797990和MG786589）序列相似性高达98.75%以上；系统进化树（图3）的结果也显示，SHZLV01 菌株与千屈菜白粉菌（E. lythri）处于同一分支上，与白粉菌属的其他种之间的序列同源性相对较低。由此证明，新疆石河子帚枝千屈菜上感染的白粉病菌与千屈菜白粉菌（E. lythri）存在极大的亲缘关系。

综合病菌的形态特征和rDNA-ITS 区序列的比对和分析结果，将引起石河子市区帚枝千屈菜白粉病的病原鉴定为千屈菜白粉菌（Erysiphe lythri），这是该病菌在新疆的初次发现和报道。

3 结论与讨论

帚枝千屈菜由于其很强的环境适应性和优良的观赏价值，已在很多城市作为城市绿化美化的花种之一，白粉病的发生严重影响了其观赏性能。BRANISLAV 等[4]报道了引起南斯拉夫千屈菜（L.salicaria）白粉病的病原为Erysiphe lythri，并对病菌的形态特征进行了描述，认为该病菌的分生孢子和分生孢子梗很少，对无性世代特征描述较简单。刘铁志等[5]报道了在内蒙古的千屈菜（L. salicaria）上有该病菌的侵染，并描述了其形态特征。本研究中在石河子市区帚枝千屈菜（L. virgatum）上的白粉病菌的特征与已报道的基本一致。菌株rDNA-ITS 区序列的BLAST 比对时发现，该序列与已登录的来自黑龙江的千屈菜（L. salicaria）白粉病菌E. lythri（登录号：MG797990 和MG786589）序列同源性最高，但来自黑龙江菌株的形态特征并未见报道。本研究将病菌形态学观察和分子生物学鉴定相结合，将引起新疆帚枝千屈菜白粉病的病原确定为千屈菜白粉病菌（Erysiphe lythri），这是该病菌引起帚枝千屈菜白粉病的首次报道。