超高效液相色谱-串联质谱法测定桃中春雷霉素残留量

刘 炜 ，刘 行 ，杨晓凤 ，尹 全 ，毛建霏 ，张义蓉 ，陈龙飞

（1.四川省农业科学院分析测试中心，四川成都610066；2.四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，四川成都610300）

春雷霉素是放线菌产生的代谢产物，属氨基糖苷类抗菌素，分子式为C14H25N3O9[1]，1963 年从日本奈良县春日神社的土壤中分离出第一株链霉菌，我国的春雷霉素产生菌是1964 年在江西土壤中分离出的小金色链霉菌[2-3]。春雷霉素是农学、医学两用抗生素类杀菌剂，具有较强的渗透性和内吸性[4]，主要是通过抑制病菌菌体的蛋白质合成，抑制菌丝伸长并导致细胞颗粒化，干扰病菌在农作物植株内生长繁殖，从而达到防治病害的目的，对防治西瓜、黄瓜、桃、番茄、马铃薯、水稻等多种农作物的细菌、真菌病害有效[5-7]，作为高效、广谱、低毒、无公害生物农药，急性毒性较低，是较理想的杀菌剂。日本和欧盟规定春雷霉素在水果中最大残留限量值均为0.2 mg/kg[8]。

春雷霉素因具有极性强、在水中溶解度大、无紫外吸收特性，在液相色谱柱上保留能力弱，与杂质不能完全分离，分析检测难度大[9]。目前，春雷霉素的检测方法还没有国家和行业标准，虽然在水、土壤、黄瓜、糙米、农药制剂等样品中春雷霉素的检测方法[10-17]已有相关文献，但在桃中春雷霉素的残留分析方法尚未见报道。

本研究以桃为试验对象，建立了超高效液相色谱- 串联质谱测定桃中春雷霉素残留的分析方法，可满足桃中春雷霉素残留的检测要求，为春雷霉素的科学使用以及在食品中的残留分析和风险评估提供重要依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试桃购买于农贸市场。

1.2 试剂

春雷霉素标准品（纯度≥98%，德国Dr. E 公司）；甲醇、乙腈（LCMS 级，德国 Merck 公司）；甲酸（HPLC 级，上海安谱实验科技股份有限公司）；氯化钠（分析纯，四川西陇化工有限公司）；超纯水。

1.3 主要仪器与设备

超高效液相色谱- 串联质谱仪，配电喷雾电离源（ESI）（Waters XEVO TQ-XS，美国 Waters 公司）；JA3003 分析天平（万分之一天平，上海精密科学仪器有限公司）；高速匀浆机（T18 ULTRA-TURRAX，德国 IKA 公司）；高速离心机（Neofuge 18R，香港力康生物医疗科技控股集团）；超纯水仪（UPL-1-100L，四川优普超纯科技有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 标准溶液的配制 准确称取10.0 mg 春雷霉素标准品至10 mL 的棕色容量瓶中，超纯水定容，得到1 000 mg/L 的标准储备溶液，存放于-18 ℃冰箱中。临用前，根据需要将其稀释成不同浓度的标准工作液。

1.4.2 桃前处理 称取5.00 g 均质桃样品于50 mL离心管中，加入10 mL 1.0%甲酸的甲醇溶液高速匀浆1 min，于8 000 r/min 下离心5 min，后吸取上清液于50 mL 离心管。残渣中加入10 mL 1.0%甲酸的甲醇溶液，高速匀浆1 min，8 000 r/min 下离心5 min，吸取上清液，并且合并2 次上清液，加入5 g NaCl，振荡1 min，吸取1.0 mL 上清液过0.22 μm 有机滤膜，滤液用于高效液相色谱- 串联质谱检测春雷霉素。

1.4.3 液相色谱- 串联质谱条件

1.4.3.1 液相色谱条件 色谱柱Waters ACQUITY UPLCBEH Amide Column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；样品室的温度15 ℃；流动相为乙腈溶液∶0.2%甲酸水溶液＝60∶40（V/V）；流速0.3 mL/min；进样体积 1.0 μL。

1.4.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾电离，正离子模式（ESI+）；毛细管电压 3.0 kV；锥孔电压 40 V；离子源温度150 ℃；脱溶剂温度600 ℃；脱溶剂气流量1 000 L/h；锥孔反吹气 150 L/h。多反应监测（MRM）模式下，以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，以母离子和响应值最高的子离子进行定量分析（表1）。

表1 春雷霉素质谱条件

1.4.4 标准曲线制作 准确移取春雷霉素储备液，并依次稀释，配制成 10、20、40、100、200、400、1 000 μg/kg 的基质匹配标准溶液，在1.4.3 的液相色谱- 串联质谱条件下进行测定，以标准工作溶液的质量浓度对应各组分色谱峰面积作图，绘制线性关系曲线。

1.4.5 添加回收率测定 采用空白桃样品，进行加标水平为 10、100、200 μg/kg 的回收率试验，每个加标水平重复测定7 次，测定回收率及相对标准偏差。采用向空白样品中逐级降低加标浓度，在较低浓度下且春雷霉素峰形较好时，以信噪比S/N＝3，计算方法的检出限，信噪比S/N＝10 时，计算方法的定量下限（LOQ）。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的确定

考察了甲醇溶液、乙腈溶液、0.1%甲酸- 甲醇溶液、0.5%甲酸- 甲醇溶液、1.0%甲酸- 甲醇溶液、0.1%甲酸- 乙腈溶液、0.5%甲酸- 乙腈溶液、1.0%甲酸- 乙腈溶液对桃样品中春雷霉素提取效果的影响，发现1.0%甲酸- 甲醇溶液提取效果最好，回收率达到92.1%，故确定1.0%甲酸- 甲醇溶液为提取溶剂。

2.2 色谱条件的确定

春雷霉素极性大，在反相C18 色谱柱上没保留，考虑采用对极性化合物保留作用较强的亲水色谱柱，比较了Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 和Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC Column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）2 种色谱柱的分离效果，结果发现，在相同色谱条件下，春雷霉素在Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 色谱柱上保留能力较好。进一步考察了乙腈- 水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液作为流动相时对春雷霉素色谱峰的影响，综合考虑峰形、保留时间、分离度和灵敏度，发现乙腈-0.2%甲酸水溶液作为流动相时效果较好。当流动相乙腈与0.2%甲酸体积比为60∶40 时，春雷霉素的色谱峰峰形对称尖锐，且与杂质分离较好，保留时间2.84 min（图1）。故最终采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Column 色谱柱，流动相为乙腈∶0.2%甲酸＝60∶40（V/V）进行等度洗脱分离。

2.3 方法的线性关系分析

在10～1 000 μg/kg 范围内，春雷霉素的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：Y＝5.11×105X－1.80×103，相关系数为 0.999。采用向空白样品中逐级降低加标浓度，在较低浓度下峰形较好时，以信噪比S/N＝3 计算得出方法的检出限（LOD）为 3.0 μg/kg，信噪比 S/N＝10 计算出方法的定量下限（LOQ）为10.0 μg/kg。

2.4 春雷霉素在桃基质中添加回收率和精密度分析

在空白桃中按照 10、100、200 μg/kg 添加春雷霉素标准品，每个浓度7 次平行，测定回收率及相对标准偏差。结果表明，在10～200 μg/kg 添加水平范围内，添加回收率为86.2%～91.0%，相对标准偏差（RSD）为 2.2%～4.5%（表2），符合春雷霉素残留分析要求。

表2 春雷霉素残留回收率和和精密度（n＝7）

2.5 实际样品测定分析

应用所建立的方法对市售的100 份样品进行春雷霉素残留的测定，结果发现，5 份样品检出含量值分别为 0.013、0.018、0.054、0.068、0.130 mg/kg，参照日本和欧盟规定的水果中春雷霉素的最大残留限量值，其残留均未超出最大残留限量值。

3 结论

本试验所建立的方法中，春雷霉素在10～1 000 μg/kg 的范围内线性关系良好，相关系数为0.999；在添加水平为 10、100、200 μg/kg 时，平均添加回收率分别为86.2%、91.0%、89.5%，相对标准偏差（RSD）分别为 2.2%、3.7%、4.5%，方法检出限为3.0 μg/kg，定量限为 10.0 μg/kg。本试验通过色谱及质谱条件的优化，建立了超高效液相色谱- 串联质谱测定桃中春雷霉素残留的分析方法，该方法快速、简便、准确，可满足桃中春雷霉素残留检测的要求，为春雷霉素的科学使用以及食品中春雷霉素的残留分析和风险评估提供重要依据。