lncRNA BLACAT1通过抑制miR-374b-5p促进非小细胞肺癌细胞增殖和转移

李明如，林贵湖，聂振凯，张凯华

中国航天科工集团七三一医院 胸外科，北京 100074

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200 nt不编码蛋白质的RNA，研究发现其在生物表观遗传调控过程中扮演重要角色[1]。癌症的许多基因突变存在于不编码蛋白质的区域内，lncRNA的异常表达与不同的癌症类型有关[2-4]。BLACAT1是一种lncRNA，最早发现在膀胱癌中高表达，与肿瘤的发生、发展、增殖及转移密切相关[5]。研究表明BLACAT1在非小细胞肺癌组织和细胞中高表达，并调节周期蛋白D1/CDKN2B轴抑制非小细胞肺癌细胞增殖[6]。BLACAT1也可以作为海绵吸附miRNA，从而影响miRNA的表达量及生物学功能。BLACAT1通过靶向miR-361促进ABCB1蛋白的表达，加速了胃癌对奥沙利铂的耐药，为胃癌的耐药研究提供了新的思路[7]。

在此，我们围绕BLACAT1的生物学功能，通过小干扰BLACAT1（si-BLACAT1）降低BLACAT1的表达量，研究对非小细胞肺癌细胞增殖和转移的影响；并且，通过软件预测BLACAT1相互作用的miRNA为miR-374b-5p；结合BLACAT1与miR-374b-5p探讨其对非小细胞肺癌细胞增殖和转移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人非小细胞肺癌细胞A549、HCC827、NCIH1299、NCI-H23和正常肺上皮细胞BEAS-2B购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；DMEM培养基、RPMI1640培养基和胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；谷氨酰胺和100 mmol/L丙酮酸钠溶液购自Invitrogen公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒购自日本东仁化学公司；Transwell购自 Corning Costar公司；si-BLACAT1、si-NC 和miR-374b-5p mimics（模拟物）购自上海吉玛制药技术有限公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和SYBR Green试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）引物、LipofectAMINE 2000购自Invitrogen公司；MMP-2抗体、MMP-9抗体、E钙黏蛋白抗体、N钙黏蛋白抗体和二抗均购自Abcam公司。

1.2 肺癌中BLACAT1的组织表达分析

采用starBase泛癌症平台挖掘癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据，分析肺癌组织与癌旁组织中BLACAT1的表达差异。

1.3 细胞培养

人非小细胞肺癌细胞株A549和正常肺上皮细胞株BEAS-2B采用DMEM培养基与FBS体积比为9∶1的完全培养基培养；人非小细胞肺癌细胞 HCC827、NCI-H1299和 NCI-H23采用 RPMI 1640培养基、FBS、谷氨酰胺、100 mmol/L丙酮酸钠溶液的体积比为88∶10∶1∶1的完全培养基培养。所有细胞均在5% CO2、37℃培养箱中生长，选择对数生长期细胞进行后续实验。

1.4 RNA提取和逆转录

用总RNA提取试剂盒提取细胞RNA，Nano⁃Drop检测纯度；用逆转录试剂盒合成cDNA，-20℃保存备用。miR-374b-5p的逆转录引物为5'-GT CGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCA CTGGATACGACCACTTAG-3'。

1.5 qRT-PCR检测

采用SYBR Green染料法检测各细胞系中BLACAT1和miR-374b-5p的转录水平，qRT-PCR检测仪检测结果。根据NCBI官网公布的序列设计引物。BLACAT1正向引物为5'-ATCCCTGGA GGAAGTCGTCA-3'，反向引物为5'-CCCACGAGG AAAACCCTTGA-3'；miR-374b-5p正向引物为5'-ATATAATACAACCTG-3'，反向引物为5'-TGAGG TGCTGTGCGTGAC-3'；GAPDH正向引物为5'-GA AGGTGAAGGTCGGAGT-3'，反向引物为5'-GAA GATGGTGATGGGATTTC-3'；U6正向引物为5'-C TCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物为5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.6 细胞转染与细胞活力检测

将细胞以1×104/孔接种到6孔板中培养，当细胞覆盖度达50%～60%时，用LipofectAMINE 2000分组转染细胞，培养48 h后进行后续实验。将分组转染后的细胞按5×103/孔接种到96孔培养板中培养，待细胞覆盖率达80%～90%时弃去培养基，PBS洗3次，加入用不含血清培养基稀释的10% CCK-8反应液，将加入反应液的96孔板于37℃恒温培养箱中反应40 min，取出96孔板，放入酶标仪中检测D450nm值。

1.7 细胞迁移和侵袭检测

Transwell检测细胞迁移，LipofectAMINE 2000转染48 h后的细胞按5×104/孔置于上室中，继续培养24 h，4%多聚甲醛固定后DAPI染细胞核，荧光显微镜拍照记录，细胞迁移数目百分比计算细胞迁移率。侵袭实验用含基质胶的Transwell上室接种转染48 h后的细胞1×104/孔，下室加入含10%血清的培养基，继续培养24 h，4%多聚甲醛固定后DAPI染细胞核，荧光显微镜记录细胞侵袭能力，细胞侵袭数目百分比计算细胞侵袭率。

1.8 双萤光素酶报告基因实验

将含miR-374b-5p结合位点的BLACAT1及Mut-BLACAT1插入pmir-GO构建载体，用Lipo⁃fectAMINE 2000与miR-NC、miR-374b-5p mimics共转染细胞，48 h后检测萤火虫萤光素酶和海参萤光素酶活性。相对萤光素酶活性为萤火虫萤光素酶活性值/海参萤光素酶活性值。

1.9 转移相关蛋白表达水平检测

用胰酶消化转染处理的细胞，细胞裂解液裂解细胞，离心分离蛋白和细胞碎片，BCA法检测细胞悬液中的蛋白浓度。样品中加入上样缓冲液，于100℃水浴锅煮10 min，进行电泳实验。电泳结束后，恒流转膜2 h。采用5%脱脂奶粉进行蛋白封闭2 h，再与一抗4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，加入二抗孵育1 h，最后加入ECL化学发光液，通过凝胶成像仪观察蛋白条带结果。

1.10 统计分析

采用GraphPad Prism 7.0对实验数据进行统计分析，实验均重复3次及以上，数据平均值用x±s表示，单因素独立样本数据比较用t检验或单因素方差分析，双因素2组及以上采用双因素方差分析，实验数据均服从正态分布，双边分析P<0.05表示有显著性差异，具有统计学意义（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2 结果

2.1 BLACAT1在肺癌组织及癌旁组织转录水平差异

通过starBase分析BLACAT1在肺腺癌、肺鳞癌与癌旁组织的表达差异，样本中有526例肺腺癌及59例癌旁组织，以及501例肺鳞癌及49例癌旁组织。结果显示，BLACAT1在肺腺癌和肺鳞癌组织中的表达量均高于相应癌旁组织（图1），差异具有统计学意义（P<0.001）。

2.2 BLACAT1在非小细胞肺癌细胞系与正常肺上皮细胞中的转录水平差异

通过qRT-PCR检测BLACAT1在非小细胞肺癌细胞A549、HCC827、NCI-H1299、NCI-H23和正常肺上皮细胞BEAS-2B中的转录水平差异，结果见图2，非小细胞肺癌细胞系中BLACAT1的转录水平均明显高于正常肺上皮细胞BEAS-2B。比较几组非小细胞肺癌细胞转录水平发现，A549细胞的BLACAT1表达量高于另外3组肺癌细胞，差异具有统计学意义（P<0.001）。

图1 BLACAT1在肺癌组织与癌旁组织中的差异表达

2.3 BLACAT1对非小细胞肺癌细胞活力影响

采用CCK-8细胞活力检测试剂盒分析BLACAT1对A549细胞活力的影响，结果见图3，si-BLACAT1组A549细胞活力相比空白对照组明显下调，并存在时间效应，差异具有统计学意义（P<0.001）。结果表明敲低BLACAT1表达能明显抑制A549的细胞活力。

2.4 BLACAT1对非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭能力影响

Transwell检测BLACAT1对A549细胞迁移和侵袭能力的影响，结果见图4。相比空白对照组，si-BLACAT1组细胞迁移和侵袭细胞数均明显下调，细胞迁移和侵袭的数量减少，差异具有统计学意义（P<0.001）。结果表明敲低BLACAT1能够明显抑制A549细胞迁移和侵袭能力。

2.5 验证BLACAT1作为海绵吸附miR-374b-5p

图2 qRT-PCR检测非小细胞肺癌细胞系

starBase软件预测的肺癌中与BLACAT1存在相互作用的miRNA为miR-142-5p、miR-374b-5p、miR-378c和miR-20b-5p。qRT-PCR检测空白对照组、si-NC组和si-BLACAT1组中各miRNA相对mRNA水平（图5A），结果显示，相比si-BLACAT1组各miRNA的mRNA水平，miR-374b-5p的mRNA水平明显上调（P<0.001）。

为了进一步验证miR-374b-5p是否为BLACAT1海绵吸附的miRNA，采用双萤光素酶报告基因实验验证空白对照组、miR-NC组和miR-374b-5p mimics组中相对萤光素酶活性（图5B、C），结果显示WT的miR-374b-5p mimics组相对萤光素酶活性明显下调，说明BLACAT1作为海绵吸附miR-374b-5p，降低其mRNA水平。

2.6 BLACAT1/miR-374b-5p对非小细胞肺癌细胞活力的影响

采用CCK-8细胞活力检测试剂盒评价BLACAT1/miR-374b-5p对A549细胞活力的影响，结果见图6。相比空白对照组，p-BLACAT1组A549细胞活力明显增加（P<0.001），miR-374b-5p mimics组A549细胞活力明显降低（P<0.001），差异具有统计学意义。以上结果表明BLACAT1通过抑制miR-374b-5p能够增加A549细胞活力。

图3 CCK-8检测BLACAT1对A549细胞活力的影响

2.7 BLACAT1/miR-374b-5p对非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

采用Transwell培养，荧光显微镜观察BLACAT1/miR-374b-5p对A549细胞迁移和侵袭能力的影响（图7A）。结果表明，相比空白对照组，p-BLACAT1组细胞迁移和侵袭能力均明显上调，表现为荧光显微镜观察到细胞迁移和侵袭的细胞数增加，差异具有统计学意义（P<0.001）；miR-374b-5p mimics组细胞迁移和侵袭能力均明显下调，表现为荧光显微镜观察到细胞迁移和侵袭的数量减少，差异具有统计学意义（P<0.001）；p-BLACAT1±miR-374b-5p mimics组细胞迁移和侵袭能力没有明显差异。

采用Western印迹检测与肿瘤转移相关蛋白的表达水平，结果显示，与空白对照组相比，p-BLACAT1组细胞MMP-2、MMP-9和N钙黏蛋白明显上调，差异具有统计学意义（P<0.001），E钙黏蛋白的表达没有明显差异（P=0.091）；miR-374b-5p mimics组细胞MMP-2、MMP-9和N钙黏蛋白明显下调，E钙黏蛋白的表达明显上调，差异具有统计学意义（P<0.001）；p-BLACAT1±miR-374b-5p mimics组细胞MMP-2和E钙黏蛋白没有明显差异（P=0.416；P=0.998），MMP-9蛋白和N钙黏蛋白的表达存在明显差异（P<0.001；P=0.0017），差异具有统计学意义。

以上结果表明BLACAT1通过抑制miR-374b-5p的表达促进A549细胞迁移和侵袭。

3 讨论

图4 Transwell检测BLACAT1对A549细胞迁移和侵袭能力的影响

图5 验证BLACAT1作为海绵吸附miR-374b-5p

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率居前，确诊的患者往往为癌症晚期，转移性强，预后差[8-9]。传统治疗手段如手术、化疗和放疗治疗效果有限，且化疗和放疗的副作用大，故选择有效的补助治疗手段成为亟待解决的问题[10]。根据细胞来源不同及镜下细胞形态，可将肺癌分为小细胞癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌为肺癌发病的主要类型，占85%[9]。非小细胞肺癌分为腺癌、鳞癌和大细胞癌[8]。BLACAT1作为一种长链非编码RNA，在肺腺癌及肺鳞癌组织中高度表达。研究发现，BLACAT1可以作为miRNA的靶点，与mRNA竞争性结合相应miRNA，从而降低miRNA的转录水平，提高该miRNA靶基因mRNA的转录及蛋白表达水平[7]。

图6 CCK-8检测BLACAT1/miR-374b-5p对A549细胞活力的影响

本研究目的为探究BLACAT1在非小细胞肺癌细胞系中的生物功能。体外培养非小细胞肺癌细胞系，筛选BLACAT1高表达细胞系A549，研究BLACAT1对A549细胞增殖和转移的影响。为了进一步探讨BLACAT1的生物功能机制，利用软件预测BLACAT1作为海绵吸附的miRNA，并验证预测结果，将BLACAT1与相互作用的miR-374b-5p结合，研究BLACAT1/miR-374b-5p对A549细胞增殖和转移的影响。最终证实BLACAT1通过抑制miR-374b-5p促进非小细胞肺癌A549细胞的增殖和转移。miR-374b-5p作为miRNA家族一员，在人类肿瘤中被认为是一种抑癌基因[11-13]。已有研究表明，miR-374b-5p表达下调与癌细胞耐药相关，例如miR-374b-5p在功能上抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和上皮-间充质转化（EMT），并且增强细胞对顺铂的敏感性[11]。miR-374b-5p被发现在胰腺癌组织中的表达与癌旁正常组织相比显著降低，miR-374b-5p上调可改善胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性，并靶向多种抗凋亡蛋白，诱导胰腺癌细胞凋亡的发生[14]。

图7 BLACAT1/miR-374b-5p对A549细胞迁移和侵袭能力的影响

MMP-2、MMP-9、E钙黏蛋白和N钙黏蛋白均被证明与肿瘤细胞的侵袭和转移相关，其中MMP-2、MMP-9和N钙黏蛋白为肿瘤细胞转化为易转移细胞间质表型的标志物，E钙黏蛋白为正常细胞表型的标志物，当肿瘤细胞转变为间质表型时，该蛋白的表达量降低[15-17]。本研究通过Western印迹检测非小细胞肺癌细胞在BLACAT1作用下，MMP-2、MMP-9和N钙黏蛋白表达上调，E钙黏蛋白表达下调；加入miR-374b-5p的回复实验则上调以上蛋白的表达水平。

综上，可以将BLACAT1作为非小细胞肺癌治疗的新靶点，抑制肿瘤增殖和转移。