IL-33对大鼠颅脑创伤后认知障碍的初步研究

罗 海，侯世科，涂 悦

(武警特色医学中心 急诊医学科，天津 300162)

创伤后认知功能障碍病理学的标志包括β淀粉样蛋白(Aβ)组成的细胞外淀粉样蛋白斑块沉积、纤维结节在脑神经细胞内形成，以及突触功能障碍[1]。研究表明白细胞介素-33(IL-33)在与受体ST2相结合后可以发挥减少 Aβ聚集、抑制细胞炎症的双重功能[2]。IL-33在出血性或缺血性损伤后可在动物海马组织中大量表达[3-4]，通过调节特异性小胶质细胞活性，抑制神经细胞的凋亡，使急性颅脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)大鼠的神经功能得到改善，其主要机制是促进小胶质细胞的募集，并增加其吞噬活性来降低海马组织 Aβ[5]。并且，遗传学研究已经确定IL-33基因中的3个单核苷酸的多态性与降低认知功能障碍的风险相关[4]。在脑和脊髓中，IL-33主要表达在少突胶质细胞，可以使小胶质细胞朝着具有增强 Aβ吞噬能力和增强抗炎基因表达的替代活化状态倾斜，从而降低脑中的促炎反应[6-7]。然而，目前仍然不清楚体外补充IL-33是否可以缓解创伤后认知功能障碍。本研究通过体外补充IL-33探索TBI后认知功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料 48只SPF级雄性健康SD大鼠，6～8周龄，体重200～300 g，购自北京维通利华。IL-33试剂(美国，Biolegend公司)；兔抗鼠白细胞介素33(IL-33)一抗、兔抗鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)一抗、兔抗鼠白细胞介素1β(IL-1β)一抗(美国，Sigma公司)；兔抗鼠β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)一抗、兔抗鼠tau一抗、兔抗鼠β肌动蛋白(β-actin)一抗(美国，Abcam公司)；蛋白酶K(瑞士，Roche公司)；TUNEL荧光试剂盒(美国，Abbkine公司)。

1.2 TBI大鼠模型制备 大鼠术前6 h禁食禁饮，皮质打击法建立大鼠TBI模型[8]。5%水合氯醛7 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，备皮，局部消毒，铺无菌洞巾。矢状切开皮肤以露出头骨，在囟点左后、右后3 mm分别钻孔，直径约5.0 mm，露出硬脑膜。调整eCCI使其与脑膜表面垂直，精确打击右侧大脑皮层以造成弥漫性损伤。实验组的打击参数为右后2.5 mm，深4 mm，打击速率6 m/s。皮质打击后立即止血，缝合头皮。所有动物均饲养于枣矿集团中心医院动物房，采用普食喂养，自由饮水。

1.3 大鼠分组及给药 取48只健康雄性SD大鼠随机均分为假手术组(sham组)、TBI组和TBI+IL-33组，每组16只。TBI组大鼠颅骨开骨窗后打击皮质，sham组仅开骨窗。TBI+IL-33组造模成功后立即给予IL-33尾静脉注射200 ng/只/d，连续3 d，其余两组分别注射等量晶体液[9]。实验3 d后每组大鼠随机取8只，安乐死后采用 Western blot法检测海马组织 IL-33、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平，荧光 TUNEL检测细胞凋亡。实验1个月后，采用Morris水迷宫评估另外8只大鼠的记忆能力，随后将大鼠安乐死，取海马组织检测β淀粉样蛋白(Aβ1-42)和tau蛋白水平。

1.4 Western blot检测 取大鼠海马组织，RIPA裂解液裂解，充分匀浆，于4 ℃离心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量法进行总蛋白定量。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，半干转移至聚偏二氟乙烯膜。用含有0.1%牛血清白蛋白的PBS在室温下将膜封闭1 h，PBST洗涤后抗体温育4 h：兔抗鼠Aβ1-42一抗(1∶1 000)，兔抗鼠tau一抗(1∶1 000)，兔抗鼠IL-33一抗(1∶1 000)，兔抗鼠IL-1β一抗(1∶1 000)，兔抗鼠TNF-α一抗(1∶1 000)和β-actin一抗(1∶1 000)。将膜用PBST清洗4次后与山羊抗兔二抗(1∶1 000)在室温下孵育2 h。PBST清洗后采用ECL试剂盒检测条带的化学发光，使用ImageJ软件分析图像。

1.5 TUNEL检测 将海马组织进行蛋白酶K抗原修复30 min，PBS洗涤3次。根据分析试剂盒使用说明书进行溶液制备和染色。使用荧光显微镜在400倍率下观察CA1区段细胞数量。细胞凋亡(%)等于荧光染色阳性细胞数/(阳性细胞+阴性细胞)×100%。

1.6 大鼠Morris水迷宫 实验直径120 cm高40 cm的水迷宫，放满水，控制水温约25 ℃。在第一象限水面下0.5 cm设置一个直径10 cm高25 cm的逃生平台。将自由活动的大鼠分别从4个象限随机放入，让其寻找隐藏在水中的平台。摄像头采集大鼠的活动并用Ethovision 3.0软件进行处理。实验包括寻找水下平台的定位航行和去除平台后的空间探索两部分，主要观察指标有:①逃避潜伏期：定位航行实验大鼠从第31天开始连续6 d从各个象限找到平台的时间，记录为逃避潜伏期；②大鼠活动情况：空间探索实验在第36天，拆掉平台，将大鼠从第Ⅱ象限放入水中，记录50 s内大鼠穿越平台位置的次数、目标象限游泳的时间[10]。

2 结果

2.1 IL-33对大鼠海马组织炎症和细胞凋亡的影响 与sham组相比，TBI组大鼠海马组织 IL-33、IL-1β、TNF-α水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，海马组织细胞凋亡比率明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与TBI组相比，TBI+IL-33组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，海马组织细胞凋亡比率明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1和图1。

表1 各组大鼠IL-33、IL-1β、TNF-α蛋白相对表达量和细胞凋亡率比较。

A：IL-33、IL-1β、TNF-α、β-actin免疫印迹条带；B：IL-33相对含量；C：IL-1β相对含量；D：TNF-α相对含量；E：各组大鼠海马组织TUNEIL荧光染色，比例尺=100 μm；F：各组大鼠海马组织细胞凋亡比率。a：与sham组相比，P<0.05；b：与TBI组相比P<0.05。

2.2 IL-33治疗对海马组织 Aβ1-42、tau表达水平及记忆功能的影响 与sham组相比，TBI组大鼠海马组织 Aβ1-42、tau水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，逃避潜伏期明显延长，差异均有统计学意义(P<0.05)，跨越隐匿平台的次数、目标象限内游泳时间明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；与TBI组相比，TBI+IL-33组大鼠海马组织 Aβ1-42、tau水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，逃避潜伏期明显缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)，跨越隐匿平台的次数、目标象限内游泳时间均明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2和图2。

表2 各组大鼠记忆功能评估

A：Aβ1-42、tau、β-action免疫印迹条带；B：Aβ1-42相对含量；C：tau相对含量；D：各组大鼠逃避潜伏期；E：各组大鼠目标象限停留时间；F：各组大鼠穿越目标象限次数。a：与sham组相比，P<0.05；b：与TBI组相比P<0.05。

3 讨论

炎症是运动神经元死亡的主要原因，TBI后的炎性改变是 TBI后认知功能障碍的诱因，这种效应归因于炎症反应的失衡，急、慢性神经炎症刺激诱导 Aβ累积[11]。在痴呆症患者中，Aβ和tau蛋白在海马组织中的异常沉积导致突触功能异常，进而导致神经元突触的坏死[12-13]。而小胶质细胞与Aβ结合可引起IL-1β和TNF-α的释放，导致神经炎症损伤神经组织，特别是慢性神经炎症，被认为加速认知功能障碍发展的重要因素[14]。在痴呆症患者的海马组织中IL-33表达降低，血清中sST2表达增加，这是由于 IL-33/ST2信号传导受损导致的，IL-33/ST2信号传导受损将会导致淀粉样蛋白斑块沉积、增加慢性神经炎症并加重认知功能障碍的症状[15]。通过以上研究，很容易推测出提高中枢神经系统中IL-33的水平可能是预防认知功能障碍的关键[16]。本研究结果显示，体外补充IL-33可以明显降低TBI大鼠脑组织tau及Aβ1-42水平，从蛋白水平证明IL-33可以改善TBI大鼠的认知障碍。事实上，遗传研究已经将 IL-33/ST2的单核苷酸多态性与临床认知功能障碍联系起来[11,17]。这些表明在动物认知功能障碍模型中的观察结果可以类推到人类身上。

最近研究发现IL-33可以动员先天免疫来预防和清除既定的Aβ积累，为认知功能障碍的治疗提出了新方向。IL-33在出血性或缺血性损伤后可在动物海马组织中大量表达[3-4]，IL-33还可以通过调节特异性小胶质细胞活性减轻脑水肿，抑制神经细胞凋亡，改善急性脑损伤大鼠的神经功能[5]，其主要机制是IL-33通过增强小胶质细胞对 Aβ的吞噬和降解，将小胶质细胞/巨噬细胞转换为另一种活化表型，以减少认知功能障碍的促炎反应[6]。激活的小胶质细胞通过增强自身对Aβ的吞噬作用，清除和降解积累的Aβ。；然而Aβ在大脑中的持续产生和异常积累会导致Aβ受体的减少和炎症介质的增加，从而引起小胶质细胞功能障碍[6]，因此激活小胶质细胞的吞噬功能尤为重要。而在中枢神经系统中，IL-33可以在少突胶质细胞中表达，通过释放作用于小胶质细胞，使小胶质细胞朝向具有增强的Aβ吞噬能力和增强的抗炎基因表达的活化状态倾斜，从而降低海马组织中的促炎反应[7]。本研究结果显示，体外补充IL-33可以明显降低TBI大鼠脑组织IL-1β及TNF-α等炎症介质水平，证明IL-33可以抑制TBI大鼠脑组织炎症水平。

综上所述，IL-33治疗能够抑制大鼠大脑中的Aβ积累，降低TBI大鼠脑组织炎症因子 IL-1β和 TNF-α的表达水平，减少神经细胞凋亡，使记忆功能得到改善，从细胞和分子水平上诠释了IL-33可以改善TBI大鼠神经功能。因此，IL-33可能成为治疗人类TBI后认知功能障碍新的研究方向。