桃红四物汤加减方对小鼠黄褐斑的预防作用研究

刘世柱，张卫华，蔡 琳，孙文泽，安小兰，崔国祯

(1.杭州胡庆余堂国药号有限公司，浙江 杭州 31009；2.国家中药现代化工程技术研究中心 保健食品分中心，广东 珠海 519041；3.遵义医科大学 珠海校区生物工程系，广东 珠海 519041)

黄褐斑又称为“肝斑和蝴蝶斑”，是人类面部常见的皮肤色素代谢障碍性疾病，女性患黄褐斑的概率远高于男性，对患者的生活质量有一定的负面影响[1]。近几年，黄褐斑的发病率呈不断上升趋势，其防治已引起医学界的高度重视，研究人员在临床和实验研究方面做了大量的研究工作。然而，多种防治方法，均存在易复发和安全隐患等问题[2]。黄褐斑的发病机制尚未完全阐明，目前的研究表明，引起黄褐斑的致病因素众多。研究发现紫外线辐射、内分泌失调、氧自由基、药物和化妆品不正当的使用及遗传等因素是引起黄褐斑的主要原因[3]。

中医学认为“无淤不成斑”，气滞血淤导致面部黑色素沉着形成斑块。人体在中医学上被视为一个有机整体，肝、脾和肾这三个脏器的失调是黄褐斑发病的关键，中医的防治理念主要是“疏肝理气，活血化瘀”。基于以上中医理论，以桃红四物汤(由当归、生地、川芎、白芍、桃仁和红花组成)为基础方，结合中医理论，对本方进行调整。以当归、白芍、川芎、红花、丹参和葡萄籽提取物按照一定的比例配制成防治黄褐斑的组方。从理论上讲，该配方具有活血通脉、补血养颜和祛斑的功效。本研究以黄褐斑小鼠模型为实验对象，观察该复方对黄褐斑的预防作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种SPF级雌性小鼠40只(购买于广东省实验动物中心)体重35～40 g，饲养于遵义医科大学珠海校区实验动物中心，屏障环境动物房(室温22±1 ℃，12 h光照/12 h黑暗)，动物许可证号为：[SCXK(粤)2013-0002]。

1.2 药品与试剂 当归、白芍、川芎、红花和丹参(广州至信药业股份有限公司)；葡萄籽提取物(原花青素含量为95%，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司)；黄体酮注射液(浙江仙珺制药股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；酪氨酸酶(Tyr)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；抗黑色素瘤特异抗体(HMB45)(福建迈新生物有限公司)；DAB试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；8% Na2S水溶液(广州化学试剂厂)。

1.3 实验仪器 波长为320 nm，功率为15瓦的紫外线灯(深圳市冠雅光科技有限公司)；奥林巴斯生物显微镜(日本OLYMPS公司)；组织切片机(RM2235型，德国莱卡公司)；全自动酶标仪(WLX800UV，美国宝特)；GZX-9070 MBE型电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；生物组织自动包埋机(TB-718E型)、智能程控生物组织自动脱水机(TC-120型)(湖北泰维科技实业有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物及分组 将40只体重为35～40 g的昆明种SPF级雌性小鼠(购买于广东省实验动物中心)，随机分为对照组、模型组、桃红四物汤加减方低剂量组和高剂量组，每组各10只，分别对各组称重并标记，分笼饲养。

1.4.2 模型制备 参照文献报道的方法[4]，采用注射黄体酮配合紫外线照射法进行造模。用电动剃须刀配合8%Na2S水溶液将小鼠背部的毛剃干净，使面积约3 cm×3 cm的背部皮肤充分暴露出来，每3天处理1次。对照组注射生理盐水，其余3组每日按剂量20 mg/kg注射黄体酮，注射部位为小鼠后肢根部肌肉，两侧轮替注射。同时，采用黄褐斑动物模型构建用的紫外线照射装置[5]，以波长为320 nm的中波紫外线每日照射小鼠30 min，连续照射30 d。

1.4.3 给药方式 复方由当归、白芍、川芎、红花、丹参经水提后加入葡萄籽提取物混合而得。中药比例为，当归∶白芍∶川芎∶红花∶丹参比例为1.5∶2∶1∶1∶1.5。水提物干重占原药材干重约为39.8%。葡萄籽提取物每日用量相当于原花青素0.19 g。在造模的同时均对各组进行灌胃给药，对照组和模型组给予等量蒸馏水，药物处理组按照桃红四物汤加减方的低剂量组(0.94 g/kg)和高剂量组(2.82 g/kg)每日给药1次，连续30 d。

1.4.4 小鼠血清各项指标检测 最后1次给药结束后，禁食12 h，用8%Na2S水溶液配合电动剃须刀将小鼠背部毛剃干净后，使用10%水合氯醛麻醉小鼠。待小鼠进入麻醉安乐死后，随后摘除眼球取血于抗凝采血管中，放置于4 ℃冰箱中过夜，4 ℃，1 000 g离心10 min，取上清液部分，按照试剂盒的说明书操作，进行小鼠血清SOD活性和MDA及Tyr含量的检测。

1.4.5 小鼠肝脏各项指标检测 将取完血的实验小鼠安乐死后，取约0.1 g的肝脏组织放入玻璃匀浆器中，加入0.9 mL生理盐水进行匀浆，将溶液装入1.5 mL EP管中，在转速为10 000 g的4 ℃离心机中离心10 min，取上清部分，于-20 ℃保存备用，按照试剂盒的说明书，进行肝脏SOD活性和MDA及Tyr含量的检测。

1.4.6 HE染色 取面积约1 cm×1 cm的小鼠背部皮肤置于4%多聚甲醛(PFA)的EP管中进行固定，于4 ℃冰箱中放置12 h，用常规石蜡包埋切片，按照报道的方法[6]，进行HE染色，用显微镜观察小鼠皮肤中病理形态学变化。

1.4.7 免疫组织化学 分别取各组小鼠背部去毛皮肤1块(1 cm×1 cm)，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，再经烤片、脱蜡水化和抗原修复液(枸橼酸盐溶液)修复，按照试剂盒说明，用HMB45抗体孵育后，然后孵育二抗，接着用DAB显色液进行显色。同时，用PBS替代一抗，设立阴性对照组。皮肤组织切片有明确棕黄色着色或褐色为阳性表达。每张切片随机选取5个视野进行拍照。然后用图像分析软件IPP 6.0(Image-Pro Plus 6.0)对全图进行光密度分析，分析每张图片的积分光密度(IOD)值，用于观察皮肤中黑色素沉着变化。随后用苏木素对切片进行复染，拍照。

2 结果

2.1 桃红四物汤加减方对小鼠血清和肝脏的SOD活性及Tyr和MDA含量的影响 由表1可见，与对照组比较，模型组小鼠血清中的SOD活性明显降低，Tyr和MDA含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，桃红四物汤加减方低、高剂量处理组血清中SOD活性升高，其中高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；低、高剂量组的血清中Tyr含量均有降低，其中高剂量组有统计学差异(P<0.05)；桃红四物汤加减方处理组的低剂量组MDA活性降低，其中低剂量组有统计学差异(P<0.05)。

表1 桃红四物汤加减方对黄褐斑模型小鼠血清SOD活性及Tyr和MDA含量的影响

由表2可见，与对照组对比，模型组小鼠肝脏中的SOD活性显著降低，Tyr和MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，桃红四物汤加减方组的低、高剂量组小鼠肝脏中SOD活性均升高，但与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；桃红四物汤加减方的低、高剂量组肝脏中Tyr和MDA含量均降低且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 桃红四物汤加减方对黄褐斑模型小鼠肝脏的SOD活性及Tyr和MDA含量的影响

2.2 桃红四物汤加减方对小鼠黄褐斑部位皮肤病理学的影响 由图1可知，对照组小鼠皮肤的表皮层的上皮细胞排列整齐、无明显增生。模型组小鼠皮肤表皮的上皮层细胞增生明显，细胞核变圆且排列紊乱。与模型组相比，桃红四物汤加减方的低和高剂量组小鼠皮肤上皮层细胞病变有所改善，上皮细胞增生少，细胞核排列规则。

A:对照组；B:模型组；C：低剂量组；D：高剂量组。

2.3 小鼠皮肤HMB45表达情况 抗黑色素瘤抗体HMB45可鉴别含黑色素的病变组织，用该抗体检测桃红四物汤加减方对皮肤黑色素的干预作用。免疫组织化学结果(见图2和表3)显示，模型组所有的小鼠基底细胞及棘细胞层中出现大量棕黄色物质(如箭头所示)，呈强阳性反应。与对照组比较，IOD值增大，着色变深，有统计学差异(P<0.05)，而皮肤中黑色素细胞显著增多是黄褐斑模型的直接证据[4]，表明黄褐斑小鼠模型建立成功。相比之下，桃红四物汤加减方的低剂量组，基底细胞及棘细胞层中可见少数棕黄色物质，较模型组有一定减少，与模型组比较，IOD值减小且具有统计学差异(P<0.05)；桃红四物汤加减方的高剂量组：基底细胞及棘细胞层中可见少量棕黄色物质，较模型组减少很多，接近于对照组，与模型组比较，IOD值明显减小，具有统计学差异(P<0.05)。以上结果提示，该桃红四物汤加减方能有效减少黑色素细胞的形成，对黄褐斑模型小鼠有一定的预防作用。

A:对照组；B:模型组；C：低剂量组；D：高剂量组。

表3 小鼠皮肤HMB45免疫组化染色的积分光密度变化

3 讨论

黄褐斑为两颊和额等面部色素过度沉着形成的一种皮肤病，严重影响患者的容貌。本研究结果显示，与模型组比较，桃红四物汤加减方低、高剂量组的SOD活性均升高，MDA和Tyr含量均降低，皮肤中黑色素减少。表明该方水提物对小鼠的黄褐斑模型具有一定的防治作用，可能与降低Tyr的含量，提高SOD活性，减少MDA的产生，进而减少黑色素细胞数量有关，为防治黄褐斑提供科学依据。

中医学认为黄褐斑的发生与人体内肝、脾、肾的代谢失调，导致的气血不顺，血瘀阻塞有关[7]。中药治黄褐斑的理论是调节脏器代谢，祛除血瘀，疏通经脉，具有一定的优势。最近的系统综述分析表明，中药通过调节与黑色素生成相关的基因或信号通路，对黑色素的生成具有多层次的抑制作用，对于防治皮肤色素异常具有重要的临床价值[8]。目前，已有多种复方中药用于黄褐斑的防治且取得良好疗效的报道。古代经典名方桃红四物汤始见于《医宗金鉴》，具有活血化瘀和养血消斑等功能，对黄褐斑有一定的治疗效果[9]。然而，桃红四物汤在防治黄褐斑方面，由于其疗效和安全性尚有不足，有待于进一步的改进。本研究所用的中药组方，以桃红四物汤的配方为基础，将生地换为丹参，桃仁换为葡萄籽，保留当归、川芎、白芍和红花。以此六种药合用，具有活血祛瘀、疏肝益气之功效，从中医理论思考，对黄褐斑有整体的预防作用。

黄褐斑的具体确切发病机制目前尚不清楚，但是研究者们发现其发生与多种因素有关。首先，黑色素的含量及其活性对黄褐斑的严重程度有显著影响[10]。在酪氨酸酶的作用下，以酪氨酸为底物，生成多巴，多巴进一步被氧化生成多巴醌，并最终通过络氨酸酶氧化成黑色素[11]。其次，酪氨酸酶是产生黑色素的速度限制酶，其含量升高，黑色素生成增加。然后，这一系列的氧化反应会破坏体内氧化和抗氧化反应的平衡，产生过量的氧自由基，造成SOD等抗氧化酶活性的下降，导致膜脂质过氧化，分解生成醛类，即丙二醛含量增加。此外，紫外线能提高酪氨酸酶活性和黑色素含量，而雌激素则可以提高黑色素细胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑色素细胞含量[12]，因此我们选择小鼠后腿根部肌肉注射黄体酮联合紫外线照射制造黄褐斑小鼠模型，在一定程度上能模拟人体的发病与病理变化。本实验采用该小鼠黄褐斑模型，发现桃红四物汤加减方能显著升高血清和肝脏中的SOD活性，降低Tyr含量，减少皮肤酪氨酸酶的表达，可能是预防黄褐斑发生的作用机制之一。

综上所述，本研究以中医药传承和创新的研究思路为指导，对桃红四物汤的组方进行调整，发现其对注射黄体酮联合紫外致黄褐斑小鼠模型具有较好的预防效果，其机制可能与降低酪氨酸酶含量，提高超氧化物酶活性，维持体内氧化反应平衡，减少黑色素的形成有关。其次，组方的原料均属于国家卫计委公布的中药范围，可用于一般食品和保健食品，安全隐患较小。鉴于该组方具有安全有效的特点，值得在临床上推广应用。同时，本研究还拓展了中药防治黄褐斑的配方，为临床预防黄褐斑提供科学依据。