款冬组培快繁技术研究

王杰 韩梦豪 许琳玉 刘仪云 许家月 陈苏丹

摘要：为解决款冬生长周期长的问题，以款冬幼嫩无病虫害侵染的叶片为试材，采用组培快繁技术，对其进行离体培养，包括诱导愈伤组织、叶片增殖培养、生根培养、驯化移栽4个过程。结果表明：最适诱导愈伤组织培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+2mg/LNAA，最适芽增殖分化培养基为MS+0.2mg/L NAA+2.0mg/L zT，最适生根培养基为1/2 MS+0.5mg/L NAA，最适移栽基质为珍珠岩：蛭石：泥炭土=3：1：6。

关键词：款冬;组织培养;愈伤组织;驯化移栽

款冬（Tussilago farfara L）为菊科款冬属多年生草本植物，别名冬花、九九花，头状花序，花期2～3月。款冬花为我国传统中药材，历代《中国药典》均有收载。其性温、味辛、微苦、归肺经，具有平喘、升压、抗炎、抗肿等功效，临床使用十分广泛。近几年，环境污染所带来的一系列问题成為人们关注的热点，尤其是雾霾天气引发的健康问题更是令人焦虑。人体吸入空气中的杂质和有毒气体，导致咳嗽、呼吸困难等呼吸道疾病，严重影响着人们的身体健康。研究表明，款冬能有效地缓解上述并发症，有止咳、化痰、润肺之功效。但目前款冬花野生资源遭受严重的破坏，且人工栽培周期长，种植面积少，导致市场供不应求。本试验以款冬为试材，建立完整组培体系，以期为进一步的工厂化、规模化生产育苗提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验地概况

试验于2018年9月～2019年6月在河南省洛阳市河南科技大学（112°24E，34°35N，）进行。洛阳市位于暖温带地带，属大陆性气候。洛阳市年平均温度为11～24%，与款冬天然生长气候环境大致相同。

1.2试验材料

款冬采集于河南省三门峡市卢氏县，并移栽至河南科技大学开元校区统一管理。

1.3方法

1.3.1叶片的消毒处理。试验采用生长旺盛、无病虫害侵染的幼嫩叶片。先用淡洗衣粉水浸泡5min，轻微搅拌，然后流水冲洗0.5h，除去残余。款冬叶片表面覆盖细小绒毛，灭菌较为困难，因此用棉签轻轻擦拭表面可以使消毒剂达到良好效果。本试验设置75%乙醇、0.1g/L HgCI2分别处理30s、300s。

1.3.2培养条件。选用MS、1/2MS为基本培养基，培养基中加入浓度为30g/L蔗糖，8g/L琼脂，培养基pH值5.6～6.4。培养条件为：光照强度2500～3100Lx，光照时间12hid，培养温度22±3℃。

1.3.3诱导愈伤组织。将处理好的叶片在超净工作台上切成约1cm²的小正方形，接种于附加不同激素浓度6-BA、NAA的愈伤组织诱导培养基上。每组接种30瓶，每瓶接种3小块叶片，在22±3℃光培养40d，诱导期间观察其生长情况。

以MS培养基为基本培养基，附加不同浓度的6-BA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L），NAA（0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L）共9组处理，上述各处理培养基均添加适量30g/L蔗糖、7g/L琼脂。培养基pH值5.6～6.4。

1.3.4芽的增殖培养。选取生长良好的愈伤组织进行芽的增殖分化，将其接入附加不同浓度6一BA、NAA、zT的培养基上。每组处理接种30瓶，每瓶接种1块愈伤组织。在22±3℃、光周期12h/12h（光，暗）的条件下培养30d，培养期间观察其芽的增殖情况。以MS培养基为基本培养基，附加不同浓度的6-BA（1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L），NAA（0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L），ZT（1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L）共8组处理，上述各处理培养基均添加适量30g/L蔗糖，7g/L琼脂。培养基pH值5.6～6.4。1.3.5生根培养。选取健壮饱满的芽进行生根培养，以MS为基本培养基，附加不同浓度NAA（0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L），每组处理均添加0.5%活性炭，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH值5.6～6.4，培养30d，期间观察根的生长情况。

1.3.6驯化移栽。将根长势健壮的组培苗移人室温中，在1周之内将其瓶盖慢慢打开，再完全打开放置2～3d，取出苗洗净根部培养基。在4%高锰酸钾溶液中浸泡根部10s，移栽至珍珠岩：蛭石：泥炭土=1：1：1与珍珠岩：蛭石：泥炭土=3：1：6的2种不同基质配比中，每组处理10瓶。保持温度22±3℃，含水量（95±5）%，适当遮荫与通风，计算成活率。

2结果与分析

2.1不同植物激素对诱导愈伤组织的影响

接种3周后观察，叶片四周有明显膨大卷曲现象，大部分叶片边缘形成黄绿色的凸起物。1mg/L 6-BA浓度中长势最好;浓度为1.5mg/L 6-BA培养基中出现少量“烧苗”现象。在第6周观察时发现，浓度为0.5mg/L6-BA愈伤组织较致密，但长势弱，不具备芽的增殖分化能力;浓度为1.5mg/L 6-BA出现“烧苗”现象;浓度为1.0mg/L 6-BA培养基中诱导愈伤组织致密;浓度为1.0mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA最为突出，愈伤组织呈现出颜色淡黄绿色，致密且强壮。经分析表明，MS+I.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA是较为理想的诱导愈伤组织培养基，诱导率为90.2%，愈伤组织呈黄绿色，强壮且致密，有较强的芽增殖分化能力。试验结果如表1所示。

2.2不同植物激素对芽的增殖分化的影响

将长势良好的愈伤组织转入芽的增殖分化培养基上，2周之后观察并记录其芽诱导率。如表2所示，试验结果表明，不同浓度的6-BA和ZT分别和NAA配比，在一定的浓度范围内，芽的诱导率均呈现先上升后下降。以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA的培养基，芽数量多且健壮，基部无或有少量愈伤组织，生长情况良好，诱导率最高达65.21%。

2.3不同植物激素对生根培养的影响

当芽长到3cm左右，移人生根培养基，20d后根长有明显的伸长情况。在第4周时对试验材料进行观察记录。如表3所示，浓度为0.1mg/L NAA时平均根长最短且根较弱;浓度为0.5mg/L NAA时平均根长最长且根较健壮，达3.2cm;浓度为1.0m～LNAA时试管苗平均根长达2.6cm，且大部分培养基中存在少量愈伤组织。以上结果表明，诱导试管苗生根最适培養基为1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5%活性炭，试管苗平均根长为3.2cm，根生长健壮，根部无或有少量愈伤组织。

2.4不同基质配比对驯化移栽影响

当平均根长达到3.2cm时，对其进行驯化移栽，30天后观察并记录成活率。如表4所示，发现2种基质都较为适合试管苗的移栽，但珍珠岩：蛭石：泥炭土=3：1：6的基质成活率更高。

3结论与讨论

在处理款冬叶片时，因其背部覆细小绒毛，会影响消毒剂的消毒效果，需用棉签擦拭表面，还可将吐温-80加入75%酒精进行处理。两者相比，棉签使用更方便，去除绒毛较彻底，效果更明显。在款冬叶片诱导愈伤组织时期，得出适宜的培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA，与王贵军试验结果相比较，其诱导愈伤组织最适培养基为MS+I.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。两者结果有较小的差异，其原因可能为款冬的产地不同，生长环境不同，栽培种类不同。在此期间发现，部分愈伤组织出现“褐化”现象，出现“褐化”的原因与品种、培养基、取材季节等都有一定关系，其严重程度与酚类化合物的代谢有关，酚类化合物含量越高，“褐化”现象越严重。植物激素NAA可以在一定程度上阻碍酚类化合物的合成，缓解“褐化”的程度。

在芽的增殖分化时期，本试验采用2种不同培养基进行培养，一种是以MS为基本培养基附加不同浓度配比的NAA与6-BA，一种是以MS为基本培养基附加不同浓度比例的NAA与ZT。试验发现，2种培养基在一定浓度范围内对芽的增殖分化都有一定的促进作用，但以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA生长效果最好，试验结果与任继文等的报道结果类似。

在生根培养中得出最适培养基为I/2MS+0.5mg/LNAA+0.5%活性炭，与王贵军研究报道结果相同。基质的种类及其配比是影响款冬组培苗驯化移栽生长的重要因子，泥炭土具有巨大的吸水与保水能力，珍珠岩稳定性强，吸水性好，可以疏松土壤使根系透气。蛭石透气性好，温度变化小，有利于稳定根系的环境温度。采用这3种基质有利于款冬的生长。从此次试验得出，驯化移栽最适基质比例为珍珠岩：蛭石：泥炭土=3：1：6，成活率高达89.72%，这与韦如萍研究结果不同。出现差异的原因是不同科属的植物生长习性不同，对需水量及需氧量不同，所以对不同基质的需求量不同。

本试验建立了完整的款冬组培体系，极大地缩短了其栽培周期，为工厂化育苗提供理论依据，在一定程度上可缓解款冬野生资源紧张，满足市场的巨大需求。

（收稿：2019-09-16）