响应面法优化宁夏‘赤霞珠’皮渣中原花青素提取工艺

王海波，关玉嵩，徐飞

（武汉生物工程学院应用生物技术研究中心，湖北武汉430415）

原花青素是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮混合物，由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成［1-3］，其抗自由基的氧化能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍［4］。同时具有消炎抗菌、清除人体多余有害的自由基、预防心脑血管疾病的能力，原花青素还有抗癌、抗肿瘤、抗衰老的功效［5-8］。原花青素在自然界的分布广泛，其中葡萄是原花青素的重要来源之一，其研究也最深入、最广泛。

国内外葡萄和葡萄籽是提取原花青素的主要原料之一，而葡萄皮渣是葡萄经发酵酿酒之后的过滤残渣，主要由葡萄皮和葡萄籽组成，含有大量的多酚类物质［9-10］。目前，大量的葡萄皮渣资源被当作废弃物处理，或者直接做成简单的饲料卖给农户，易造成环境污染，再次生物利用度也较低，不符合目前生物资源循环利用的发展理念［11-12］。本试验以宁夏‘赤霞珠’葡萄经酿酒以后的皮渣为研究对象，采用超声波破碎法再联合果胶酶和纤维素酶的作用提取原花青素［13-14］，并在单因素试验的基础上进行了响应面试验和分析［15-17］，以期改进葡萄皮渣原花青素的提取工艺条件，从而为酿酒葡萄皮渣的综合开发利用及原花青素的工业化生产提供参考。

1 试验方法

1.1 葡萄皮渣的处理

宁夏‘赤霞珠’葡萄经酿酒压榨分离后的皮渣放入50℃烘箱中烘干。用中草药粉碎机（型号FW117，天津泰斯特仪器有限公司）进行粉碎，经40目筛过筛，以沸程30～60℃石油醚采用索氏提取的方法进行脱脂处理，然后50℃烘干［18］。

1.2 原花青素的标准曲线制定

精确称取原花青素标准品0.03 g，取95%的乙醇溶解定容于100 mL容量瓶中为原花青素标样。原花青素的测定及标准曲线的制作按照文献［19］的方法进行，制作的标准曲线见图1。从图1可知，标准曲线方程为y=8.991 7x+0.001 9，其中R2=0.999 1，表明原花青素浓度在0.1～0.8 mg/mL之间存在较好的线性关系，可用于后期待测样品的浓度分析。

图1原花青素标准曲线Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

1.3 葡萄皮渣中原花青素的提取和含量测定

称取0.5 g葡萄皮渣粉末按一定的料液比加入提取剂，在一定温度下浸提一段时间后将提取液按3 000 r/min离心10 min。取上清液加入乙醇进行稀释后加入6 mL盐酸正丁醇溶液和0.2 mL的0.2%硫酸亚铁氨，轻微震荡摇匀，放入94℃的水浴锅中反应40 min，冷却后于546 nm下测吸光值，将结果代入标准曲线方程中换算出待测样浓度。葡萄皮渣粉末中原花青素含量（M）的计算公式为：M（mg/g）=C·n·V/m，其中，C为提取液中原花青素质量浓度，mg/mL；n为稀释总倍数；V为提取液的体积，mL；m为每次提取时所取的葡萄籽粉末质量，g。

1.4 单因素试验

1.4.1 乙醇浓度对原花青素提取的影响称取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇浸提。浸提温度50℃，时间40 min。按照1.3中的显色方法进行吸光度的测定，计算葡萄皮渣中原花青素的含量。每个试验平行3次，此步骤下同。

1.4.2 料液比对原花青素提取的影响称取0.5 g葡萄皮渣粉末，分别选择1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，乙醇浓度为60%，温度50℃，时间40 min。

1.4.3 复合酶的添加量对原花青素提取的影响称取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，乙醇浓度为60%，取0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的复合酶（纤维素酶∶果胶酶=1∶1）分别加入烧杯中，温度50℃，时间40 min。

1.4.4 pH值对原花青素提取的影响称取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，乙醇浓度为60%，加入0.4%的复合酶，调节pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，温度50℃，时间40 min。

1.4.5 温度对原花青素提取的影响称取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，乙醇浓度60%，加入0.4%的复合酶，调节pH值为4.5，温度分别选取40、45、50、55、60、65℃，时间40 min。

1.4.6 时间对原花青素提取的影响称取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，乙醇浓度60%，加入0.4%的复合酶，调节pH值为4.5，温度60℃，提取时间分别选取40、60、80、120、140 min。

1.5 响应面法优化试验

以原花青素的含量为响应值，在单因素试验结果的基础上，设计4因素3水平响应面分析试验，以获得最佳提取条件。以物料比（A）、复合酶添加量（B）、提取温度（C）和提取时间（D）为自变量，试验设计见表1。以Design-expert8.06分析软件为辅助手段，根据Box-Behnken试验设计原理，采用Excel2010软件对单因素试验数据进行处理和分析。对响应面试验数据进行线性回归和方差分析，确定模型和因素的显著性。

表1响应面法Box-Behnken设计试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design experiment of response surface

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对原花青素提取的影响从图2可以看出，随着乙醇浓度的增加，原花青素的含量逐渐增加，其中当乙醇浓度为60%时原花青素的含量最高，为8.41 mg/g。但是，当乙醇浓度大于60%时，得率开始快速下降，表明60%乙醇浓度为葡萄皮渣中原花青素提取的有利条件。

图2乙醇浓度对原花青素含量的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the yield of proanthocyanidins

2.1.2 料液比对原花青素提取的影响从图3可以看出，当料液比逐渐增大时，原花青素的含量呈逐渐上升的趋势。当料液比为1∶20时，葡萄皮渣中原花青素含量最高，为12.66 mg/g，是料液比1∶5时的两倍。但是，随着料液比继续增加，原花青素含量开始缓慢下降。表明料液比为1∶20有利于葡萄皮渣中原花青素的提取。

图3料液比对原花青素含量的影响Fig.3 The effect of material-liquid ratio on the yield of proanthocyanidins

2.1.3 复合酶添加量对原花青素提取的影响随着复合酶添加量的增大，原花青素的含量呈快速上升并快速下降的趋势（图4）。其中，当复合酶添加量为0.4%时，葡萄皮渣中原花青素的含量最高，为14.94 mg/g。当复合酶添加量为1.2%时，葡萄皮渣中原花青素的含量为9.33 mg/g。结果表明复合酶添加量为0.4%时有利于原花青素的提取。

图4复合酶添加量对原花青素含量的影响Fig.4 The effect of complex enzyme amount on the yield of proanthocyanidins

2.1.4 pH值对原花青素提取的影响原花青素提取对pH值较为敏感。总体而言，较低pH值（pH＜5.0）条件下原花青素的含量明显比较高pH值（pH＞5.0）条件下含量高（见图5）。值得注意的是，当pH=4.5时，葡萄皮渣中原花青素的含量最高（15.22 mg/g）。当pH=6时，葡萄皮渣中原花青素的含量最低（9.78 mg/g）。表明pH 4.5为原花青素提取的有利条件。

图5 pH值对原花青素含量的影响Fig.5 The effect of pH value on the yield of proanthocyanidins

2.1.5 温度对原花青素提取的影响随着浸提温度的不断升高，原花青素的含量也随之上升，其中在60℃时葡萄皮渣中原花青素含量最高，为21.23 mg/g（见图6）。但当浸提温度继续升高时，原花青素的含量开始下降。这些数据表明60℃有利于原花青素的提取。

图6提取温度对原花青素含量的影响Fig.6 The effect of extraction temperature on the yield of proanthocyanidins

2.1.6 时间对原花青素提取的影响随着浸提时间的延长，原花青素的含量呈先上升后下降的趋势（见图7）。其中，当浸提时间达到80 min时，葡萄皮渣中原花青素的含量最高（22.11 mg/g）。当浸提时间增加到160 min时，原花青素含量反而降至最低（20.02 mg/g），表明80 min的浸提时间更有利于原花青素的提取。

图7提取时间对原花青素含量的影响Fig.7 The effect of extraction time on the yield of proanthocyanidins

2.2 响应面试验结果

通过单因素试验结果可知，料液比、复合酶添加量、提取温度、提取时间对葡萄皮渣中原花青素的含量影响较为明显，据此设计的4因素3水平响应面试验结果见表2。

表2响应面优化试验设计与结果Tab.2 Design and results of response surface optimization test

通过Design-expert8.06软件进行多元回归拟合分析得到4个因素与原花青素含量之间的二次多项式模型为

式中，M为原花青素含量预测值。

二次多项式模型的方差分析见表3，由表3可知各因素与响应值之间关系的显著性，该模型的P＜0.000 1表明此模型具有高度的显著性。失拟性P=0.177 9（＞0.05），失拟性具有不显著性。R2=0.960 1说明响应值的变化有96.01%来自源于所选变量，RAdj2=0.920 1说明建立的模型能够解释92.01%的响应值变化，表明建立的模型为有效模型，适用于分析和预测原花青素的含量。各因素对原花青素的含量影响由大到小依次为C（提取温度）＞D（提取时间）＞A（料液比）＞B（复合酶添加量）。

图8为A、B、C、D交互影响3D图及等高线图，从图8A～8F可知，当料液比（A）和复合酶添加量（B）取值较小，提取温度（C）和提取时间（D）取值较大时，效应面曲线较陡，说明此时的A、B、C、D对原花青素的提取含量较为显著，反之则不显著。分析图8G～8L可知，当料液比（A）和复合酶添加量（B）取值较小，提取温度（C）和提取时间（D）取值较大时等高线密度大，对原花青素的提取含量较为显著，反之则不显著。与响应面得出的规律一致。观察等高线图内圈均为椭圆形说明各因素之间交互作用影响显著，通过响应面对葡萄皮渣中原花青素得率的解析得出原花青素最佳提取工艺条件为料液比1∶19.91、复合酶添加量0.4%、提取温度59.77℃、提取时间80.42 min，此时葡萄皮渣中原花青素的含量最大理论值为22.935 1 mg/g。

表3响应曲面二次多项式模型的方差分析Tab.3 Variance analysis of the quadratic polynomial model of response surface

图8 A，B，C，D交互影响3D图及等高线图Fig.8 A,B,C,D interaction 3D map and contour map

2.3 模型的验证性试验

以响应面优化试验中的最佳工艺提取条件结合试验条件，为方便操作则选择乙醇浓度60%、复合酶添加量0.4%、料液比1∶20、pH 4.5、提取温度60℃、提取时间80 min，根据上述条件进行3组验证试验，平均得率为22.914 mg/g，与最大理论值（22.935 1 mg/L）相接近，验证了此模型的有效性。

3 结论与讨论

此次试验通过乙醇浸提法与复合酶添加法相结合对葡萄皮渣中原花青素的提取最佳条件进行研究，得到原花青素的最佳提取条件为：乙醇浓度60%、复合酶添加量0.4%、料液比1∶20、pH 4.5、提取温度60℃、浸提时间80 min，此条件下的原花青素含量最大。采用单一的有机溶剂进行提取，提取率较低且能源损耗相对较高，此次试验选用有机溶剂提取和酶提取结合试验的方法，利用二者的相互促进作用显著提高了葡萄籽原花青素提取率。

目前对于葡萄原花青素的研究、提取、利用主要集中于葡萄籽，方法主要有有机溶剂提取、微波辅助提取、超临界二氧化碳萃取等，其中以有机溶剂提取应用最为广泛［20-21］。例如，李丹丹等［22］采用乙醇浸提的方法，葡萄籽中原花青素得率为1.58 mg/g。此外，一些研究者对葡萄酿酒皮渣中原花青素浸提进行了研究，方法也多为有机溶剂提取或者有机溶剂辅以微波、酶法等手段。例如，陈月英等［23］以乙醇加微波辅助的方法，葡萄皮渣中原花青素提取率为9.12 mg/g，后辅以酶法提取，提取率提高至11.02 mg/g［24］。

葡萄酿酒皮渣主要是葡萄皮和葡萄籽，其中含有大量的果胶类物质和纤维素类物质，果胶和纤维素对原花青素的溶出具有较大影响。本试验采用的葡萄皮渣原料来自于宁夏的‘赤霞珠’葡萄经酿酒后分离所得，试验过程中采用了果胶酶和纤维素酶混合使用方法，使其分别作用于葡萄皮渣中的果胶和纤维素，促进原花青素充分溶出。在此基础上辅以响应面的方法进行分析论证，利用二者的相互促进作用，使得原花青素的提取率由最初的8.41 mg/g提高到22.91 mg/g，本改进方法对于提高宁夏‘赤霞珠’酿酒皮渣的提取率影响较为显著，取得了较理想的试验结果。

值得注意的是，本研究所得最佳工艺条件中乙醇浓度为60%，一般而言，乙醇浓度达到一定值时，一些杂质亲脂性强的成分浸出量增加，这些浸出物会与乙醇溶液结合，从而原花青素的溶解不完全，导致原花青素的提取率随乙醇浓度升高而下降［25］。从试验结果可以看出，除了乙醇浓度有一定限制外，复合酶的添加量也很重要。考虑到纤维素酶果胶酶可以使植物细胞壁破损，增加内容物的释放使得原花青素更快地溶出［26］，因此复合酶浓度增大，破壁作用也随之增强，当达到合适的限度时刚好完全溶解。但是，当继续增加酶浓度，底物浓度不能对复合酶达到饱和，酶解作用受到抑制，却导致得率下降［27］。同样，由于复合酶在发挥催化作用时需要适宜的pH值和温度，因此当pH和浸提温度过高或过低时，复合酶的作用均受到抑制，随之原花青素的得率也降低。当然，本研究结果也表明浸提时间的选择非常重要，可能是由于在一定温度条件下时间过短会导致原花青素提取不够充分，而时间过长会使得原花青素的结构被破坏。

综上，本研究利用葡萄皮渣原料这一常见废料，结合响应面法优化了原花青素提取工艺，使原花青素的得率有了较大提升，这为葡萄皮渣的有效利用奠定了基础。