近红外荧光BODIPY/aza-BODIPY染料的研究进展

岳 帅，邵竹梅，姜新东,2*

(1.沈阳化工大学 应用化学学院，辽宁 沈阳 110142；2.大连理工大学 精细化工国家重点实验室，辽宁 大连 116024)

1 引言

近红外荧光染料能够减少背景吸收、荧光、光散射，并能够提高荧光探针和化学传感器的灵敏度[1]，更重要的是，近红外区域(650～900 nm)的光在组织中具有深度穿透能力，能够进行体内成像和光动力学治疗[2]。因此，新型近红外荧光染料的合成与设计，引起了越来越多人的兴趣[3-5]。氟硼二吡咯甲川(BODIPY)荧光强、稳定，并且容易修饰。所以，人们将BODIPY染料作为生物标记的候选物[6-8]。

aza-BODIPY的结构是以氮原子取代BODIPY的meso位碳原子，使吸收光谱显著红移[9-13]。使用亚胺基取代BODIPY系统中的一个亚甲基，可以缩小分子轨道间能隙差值(图1)。事实上，aza-BODIPY的荧光量子产率要比BODIPY减少很多，然而随着仪器和设备的发展，只要荧光量子产率超过0.01就能被检测并使用。因此，新型近红外aza-BODIPY吸引了越来越多科研工作者的兴趣。

图1 BODIPY和aza-BODIPY的光学性能比较

2 aza-BODIPY染料的合成方法

相对于BODIPY，aza-BODIPY的合成方法较少[14,15]。最近，O’shea等开发了合成路线，得到了由1,3-二芳基-4-硝基-1-丁酮或3-甲基-4-硝基-1-芳基丁烷产生的对称aza-BODIPY的合成方法(图2a)[16-18]，该方法可广泛用于合成各种结构aza-BODIPY，并且，O’Shea等也报道了不对称 aza-BODIPY的合成方法(图2b)。Lukyanets报道了含有苯基的aza-BODIPY的合成方法,将邻苯二甲腈与格式试剂反应，产率10%～30%(图2c)[19]。Carreira等利用单独的2,4-二芳基吡咯或芳基稠合的2,4-二芳基吡咯，提供了更普遍、更有效的合成对称与不对称aza-BODIPY的方法(图2d)[20]。

图2 aza-BODIPY染料合成方法

3 aza-BODIPY染料的结构及应用

3.1 O’shea方法合成的aza-BODIPY

O’Shea等在2002年首次报道了aza-BODIPY1～4的合成及性质，并且溴取代的aza-BODIPY (3和4)被证实具有光动力治疗的功能。随后，O’shea等还制备了在1/7位具有—OMe/Br的氮杂-BODIPY5～7[16-18]。利用光诱导电子转移(PET)机制，aza-BODIPY8和9的二乙胺和吗啉作为质子的受体，可以对酸值感应[21]。通过内部电荷转移(ICT)调节，aza-BODIPY10和11能用作pH探针[22]。合成的具有冠醚的aza-BODIPY12，对中性小分子能够响应[23](图3)。对于aza-BODIPY13，在1,7位的2-吡啶基取代基对于金属离子的结合有着非常明确的效果。化学传感器对Hg2+有选择性[24]。引入供电子或吸电子基团，可以通过增加HOMO或降低LUMO能量进一步降低HOMO-LUMO间隙，并使相应染料的吸收发生红移[25]。如3、5位的—OMe基团和1、7位的—CN基团取代的aza-BODIPY14与母体aza-BODIPY1(图1)相比，其吸收、发射明显发生红移[26]。基于1,7-苯基取代的aza-BODIPY受限旋转，通过制限旋转芳基的引入，aza-BODIPY15具有更高荧光量子产率(高达0.81)，并减少溶液中的非辐射弛豫过程[27]。为冻结1,7位苯基的旋转，进行具有乙二醇片段连接的两个芳基取代，同时，增加aza-BODIPY16的亲水性，并将其应用于细胞内HepG2细胞成像[28]。Burgess等报道了含有NH2基的氮杂-BODIPY17[29]。含有叠氮基的aza-BODIPY18表现出对H2S的选择性[30]。羟基取代的aza-BODIPY19，是二氧化碳的传感器[31]。硼酸取代的近红外荧光染料20可以用于血液系统中葡萄糖含量的监控[32]，其原理是aza-BODIPY上作为缺电子基团的硼酸基团与过氧化氢反应生成富电子酚基团，导致其发射波长从682 nm到724 nm显著红移。相对1,3,5,7-四苯基aza-BODIPY1，用噻吩代替其苯环发生了显著红移。aza-BODIPY21具有较强的近红外荧光，在乙腈中的荧光量子产率是0.46，是非常有竞争力的近红外荧光团[33]。

图3 O’shea法合成的染料及其应用

3.2 Lukyanets方法合成的aza-BODIPY

图4 Lukyanets法合成的染料及其应用

3.3 Carreira方法合成的aza-BODIPY

为了制备2,4-二苯基吡咯，使用相应的酮(如苯乙酮)与2-苯基氮丙烯反应，在LDA或NaH存在下得到2,4-二苯基-1H-吡咯(图5)[20]，利用这种方法，已合成了许多典型的吡咯。吡咯的独特结构已经通过X射线单晶衍射证实[37]。采用Carreira的方法，这些新型吡咯适合于合成aza-BODIPY及其衍生物(图6)。Carreira等在2006年开发了具有适当取代和限制的新型荧光染料aza-BODIPY26～29(图7)[20]，新的aza-BODIPY染料拥有700～900 nm的峰值荧光，有高量子产率、窄半峰宽、高稳定性的特点。

图5 2,4-二苯基吡咯的合成

图6 用于合成BODIPY、aza-BODIPY染料的吡咯和ORTEP图[37]

图7 Carreira方法合成的染料及其应用

此外，在Carreira法的基础上，Jiang团队最近在aza-BODIPY领域中，在可旋转部分的π共轭延伸和刚性的方面取得了突破，由于刚性化和π共轭的延伸的组合效应，在近红外区域(λabs=746 nm，λem=762 nm)制备了对称的含芘aza-BODIPY30。在芘稠合的aza-BODIPY中，观察到HOMO-LUMO(轨道)带隙的最低能量吸收带降低[38]。

Jiang等成功制备了含有萘基的aza-BODIPY31a[39]，通过萘基延长π共轭系统对其光物理性质有显著影响，具有萘基的aza-BODIPY31a的最大吸收和发射波长分别为λabs=706 nm，λem=733 nm，与带有苯基的2(λabs=688 nm，λem=715 nm)的BDP相比，有显著红移。作为光敏剂aza-BODIPY31b(在甲苯中λabs=704 nm)可以产生一定的单重态氧，并且被认为是潜在地用于产生单重态氧的光敏剂。Jiang等在aza-BODIPY染料的基础上制造出近红外的荧光探针32[40]，探针32具有弱荧光，用硫醇裂解DNBS释放aza-BODIPY荧光，同时在NIR区域发出荧光(λem=755 nm，Φf=0.14)，对半胱氨酸具有高度选择性，并且检测快速。

Jiang等还报道了含噻吩基的aza-BODIPY33[41]，aza-BODIPY33在氯仿中其NIR区域吸收在760 nm处，发射在782 nm处。作为NIR型化学传感器的33对Hg2+具有高度选择性，其荧光猝灭是由于与Hg2+结合后电子从噻吩基到aza-BODIPY母核的转移,化学传感器33可用于检测MCF-7细胞中的Hg2+，表明其可用于研究Hg2+在生物系统中的作用。

修饰aza-BODIPY 的关键在于母体分子的修饰，非常有效的修饰方法之一是通过Knoevenagel反应延伸共轭系统[42-45]。在aza-BODIPY系统中的3,5位缺少甲基，Knoevenagel反应对其是无效的。使用3-乙基-2,4-二甲基-吡咯预期的产物是在3,5位上包含甲基的aza-BODIPY，但得到的是3-氨基或3-乙酰氨基BODIPY[46-48]。如上所述，表明使用Carreira方法(图2)合成aza-BODIPY的基本要求是在吡咯的α、β位具有芳基。Jiang组挑战了这一假设，在NIR区成功制备了不对称的含苯乙烯基的aza-BODIPY34和35(图8)[49]，这是一个带有苯乙烯基的新型aza-BODIPY结构，可以避免使用Knoevenagel反应。

图8 不对称苯乙烯基取代的aza-BODIPY染料

Jiao小组最近报道了一类近红外β-噻吩稠合aza-BODIPY，使用的吡咯是在Suzuki-Miyaura偶联反应中获得的[50]。aza-BODIPY36(图9)在800 nm处可以看到尖锐的吸收和荧光发射带，在700～380 nm的可见光范围内具有非常低的吸收。

图9 噻吩融合的aza-BODIPY染料

4 近红外荧光染料衍生物的合成及应用

4.1 aza-BODIPY硼中心的取代

尽管Ziessel等已经详细报道了氟原子在BODIPY体系中的取代[51]，但硼中心取代的aza-BODIPY报道较少。37结构具有B—O键，将中心硼原子与3/5位苯基的邻位相连(图10)[51]。与38[52]的无制限结构相比，37的吸收和发射最大值分别红移了88 nm和58 nm，荧光量子产率也大幅提升，这主要归因于BODIPY核的与3,5位的芳基之间的共面性增强[52]。而aza-BODIPY39中硼中心用芳基修饰，致使荧光量子产率极低，而40炔基化修饰导致荧光量子产率较高[53]，并且，Jiang等还通过X射线晶体学证实了39和40的结构(ORTEP图见图10)[54]。

图10 F取代的aza-BODIPY染料及aza-BODIPY ORTEP图[54]

4.2 1-甲基-1H-吡咯基取代3,5位的近红外荧光aza-BODIPY染料

尽管研究人员已经获得了多种aza-BODIPY体系，但目前还没有报道在3,5位上合成带有吡咯基的aza-BODIPY体系。作者曾报道了在3,5位上含有吡咯基的近红外荧光aza-BODIPY染料41和42的设计和合成(图11)[55]，染料41和42的吸收和发射最大值明显不同，41的光谱在721 nm处吸收，751 nm处发射，而42比41具有更长的吸收和发射波长(λabs=754 nm,λem=803 nm)，由于吡咯环的电子供体作用导致红移。然而，染料41和42的不同构象导致了其光物理性质的显著差异，与41相比，42中吡咯取代基的自由旋转，由于硼中心的氟原子而变得复杂，并且似乎在减慢或被禁止，这与Burgess小组报道的受约束的aza-BODIPY(由B—O键引起)和它的不受约束的前驱体之间的光谱对比一致[52,56]。此外，41和42具有较高的消光系数和较大的荧光量子产量，而42具有较大的斯托克斯位移。染料41在近红外区域稳定性好、灵敏度高、荧光量子产率高，适合标记活细胞用于近红外区域的成像检测。

图11 近红外荧光染料aza-BODIPY 41和42

在细胞染色实验中，将含量1.0×10-5mol/L染料41(在0.5%DMSO体积比的PBS中)与Hep-2细胞在37 ℃下孵育15 min，除去多余的染料后，用ArrayScan VTI HCS Reader倒置荧光显微镜进行荧光成像，激光激发波长为620 nm，结果表明，染料41可以有效进行细胞染色(图12)[55]。染料41具有可透膜性，位于细胞质中，而细胞核保持完好，未被染色。

图12 1.0×10-5 mol/L染料41在37 ℃下、0.5%DMSO的PBS中，孵育Hep-2细胞15 min的荧光显微镜成像，黑色区域为细胞核,比例尺：25 μma.白光成像;b.激发光λex=620 nm的成像;c.图像a和b的叠加

4.3 二溴化含噻吩基aza-BODIPY的单重态氧产生性能

由于3,5位具有噻吩环的aza-BODIPY染料的单重态氧产生尚未见报道，作者曾设计合成了2,6-二溴化的aza-BODIPY43和3,5-二溴化的aza-BODIPY44(图13)[57]。43和44的半峰宽(FWHM)有着显著不同，44的吸收带更窄，43的荧光寿命明显短于44的。尽管二者的荧光量子产率略有不同，但消光系数几乎相同。检测单重态氧，结果发现在2,6-位具有溴取代的43的单重态氧的产生比在3,5-位具有溴取代的44更有效。但43是比亚甲蓝弱得多的PS[58]。

图13 含噻吩基的aza-BODIPY光敏剂

4.4 具有—F/—N3/—NH2基团的近红外aza-BODIPY的合成、结构及光物理性质

aza-BODIPY通过引入一个供电子/吸电子基团，可以增加HOMO和/或降低LUMO能量，进一步减小HOMO-LUMO能级差，达到更大的红移吸收和发射带[59,60]。相比之下，在1/7位置上带有吸电子基团(如—CN)的aza-BODIPY也会使吸收/发射带红移[61]。由于氟是一种强诱导受体，引入氟原子，成功设计合成了45～48(图14)。aza-BODIPY46的固态结构通过单晶X射线分析得到了证实(图15),发现其F—CPh键距比报道的氟化物短。NaN3通过亲核取代，形成了含—N3/—NH2的aza-BODIPY49和50[62](图16)，这些aza-BODIPY在近红外区域有吸收和发射。虽然在45～48的1/7位置引入了F原子，但氟原子对光物理性质的影响微乎其微，而带有—N3/—NH2的49和50有着显著的红移，50可作为pH值的荧光探针。

图14 含氟的染料aza-BODIPY 45-48

图15 aza-BODIPY 46的ORTEP图[61]

图16 aza-BODIPY 染料49和50

4.5 甲硫基取代BODIPY/aza-BODIPY的合成及应用

甲硫基取代BODIPY/aza-BODIPY极为罕见[63-65]，Jiang课题组制备了含有—SMe基团的新吡咯，并应用于合成一系列新的BODIPY/aza-BODIPY51～55[66](图17)，为了与—SMe基团的51的光物理性质进行严格比较，我们还制备了—OMe基团取代的已知aza-BODIPY56[67]。由于ICT效应，在荧光染料中引入供电子的甲硫基可以显著降低量子产率，使光谱红移，提高消光系数和大斯托克斯位移。此外，MO计算很好地支持并解释了51和56之间吸收最大值的差异。通过HClO将BODIPY53的硫醚转化为相应的吸电子亚砜，可以恢复量子产率并使其发射光谱蓝移，染料53对HClO具有高敏感性和选择性。

图17 甲硫基取代的染料BODIPY / aza-BODIPY

4.6 Meso-CF3-BODIPY化合物的合成

一锅法合成meso-CF3-BODIPY染料[57,68-72]，PhSiCl3在这一合成中起着至关重要的作用，提供了Cl源，生成酰氯。BODIPY57～62[73](图18)吸收光谱覆盖红光区域 (λabs=553～703 nm)。与相应的R-BODIPY (R=H、烷基、芳基等)对比[52],强吸电子基—CF3基团导致吸收光谱红移。Meso-CF3-BODIPY58～61没有荧光。然而，染料62有窄的半峰宽、高摩尔消光系数和较好的荧光量子产率[41]。X-ray单晶衍射证实了meso-CF3-BODIPY59的固态结构 (图 19)。sp3杂化的硼中心出现轻微歪曲的四面体结构，这是—CF3基团的立体位阻引起的结果。

由于强吸电子—CF3基团稳定了反应生成的碳负离子，在80 ℃的低温下，通过Knoevenagel缩合反应合成了BODIPY63(图20)[74,75]。63中的二甲氨基不仅用作pH识别单元，而且又与—CF3组建了推拉系统，染料63是一种近红外pH响应的荧光探针。

Meso-CF3-BODIPY58与NBS反应，生成二溴取代meso-CF3-BODIPY64(图21),64单重态氧生成效率是母体58的2.4 倍。

图18 meso位—CF3取代的BODIPY染料57～62图19 染料59的X-ray晶体结构[73]图20 荧光染料BODIPY63图21 光敏剂BODIPY64

4.7 长波长吸收五元环BODIPY/aza-BODIPY的合成及光物理性质

五元环稠合BODIPY/aza-BODIPY具有近似平面的结构[76,77]，作者利用五元环设计合成了BODIPY/aza-BODIPY65～68[78](图22)。

为了严格比较光物理性质，还制备了新的BODIPY69(图22)。五元并环和六元并环结构的BODIPY/aza-BODIPY光谱性质几乎一致，通过X射线晶体学分析证实了BODIPY69的固态结构[78](图23)，六元环稠合的BODIPY69的母核不是平面而是扭曲的。

图22 五元环融合BODIPY/aza-BODIPY染料65～69

图23 染料69的分子结构[78]

4.8 近红外荧光aza-BODIPY探针用于L-赖氨酸的特异性检测

基于3-氯BODIPY的荧光化学传感器的反应原理[79,80]，作者对其进行新的修饰，并通过在C—Cl键中插入噻吩基来构建荧光探针(图24)[81]，在CH2Cl2中，aza-BODIPY70在近红外区域有吸收和发射(λabs/λex=732/753 nm)，具有高摩尔消光系数和中等荧光量子产率。加入Lys后，N-亲核试剂直接攻击芳环的卤素，产生氨基取代的aza-BODIPY，导致PET效应。探针70对Lys具有选择性和敏感性，并可用于检测PC3细胞中的Lys。

图24 荧光染料BODIPY 70

将2 μmol/L的70与PC3细胞在37 ℃下孵育20 min后，洗涤除去过量的染料。用ArrayScanS VTI HCS Reader倒置荧光显微镜进行荧光成像，在细胞质区域观察到强而明亮的红色荧光图像(λex=655 nm)，表明探针70具有出色的细胞膜通透性(图25)。将处理过的细胞与Lys在培养基中于37 ℃孵育20 min后，PC3细胞显示出明显的荧光衰减，显然，添加Lys 20 min后，显微镜图像的荧光强度变得很弱，表明染料70能够有效地检测活细胞内的细胞内Lys摄取。

图25 2 μmol/L染料70在37 ℃下、5%DMSO(体积分数)的PBS中孵育PC3细胞20 min的荧光显微镜图像比例尺：20 μma.红色表示细胞质区域被70染色(λex=655 nm)；b.进一步与20 μmol/L赖氨酸在37 ℃下反应20 min

4.9 对H2S的高选择性的二硝基氟苯硫解的荧光探针的合成

设计合成了一种检测H2S的“裸眼”荧光开关探针(图26)。在生理pH值7.4时，H2S的主要形态为HS-，HS-/H2S的比值约为3/1[82]。根据文献报道[83-85]，作者采用NaHS作为H2S的当量化合物[86]，加入NaHS时，通过保护DNP基团可以顺利进行裂解反应。探针71的吸收和发射最大值分别为580 nm和615 nm，探针71为强荧光，加入NaHS后，吸收最大值红移至617 nm，荧光强度显著降低90%。这些结果表明，这种DNP基团与BODIPY母核的直接连接可以有效地恢复荧光团的量子产率。然而，当通过H2S除去71中的二硝基苯以释放羟基时，72中的羟基向BODIPY母核进行电子转移，引起荧光猝灭。

将5 μmol/L的71与HCT-116和CT-26细胞在37 ℃下孵育30 min。在可视化之前，洗涤除去多余的染料。ArrayScanS VTI HCS Reader倒置荧光显微镜进行荧光成像(图27),在细胞质区域观察到强而明亮的红色荧光图像(λex=550 nm)，表明探针71具有出色的细胞膜通透性,将处理过的细胞与NaHS(20.0 μmol/L)在培养基中于37 ℃孵育50 min后，HCT-116和CT-26细胞显示出明显的荧光猝灭，并且细胞质区域中未发现明显的荧光,表明染料71能够有效检测活细胞内的细胞内HS-摄取。

图27 5 μmol/L染料71在37 ℃下孵育HCT-116、CT-26细胞30 min，而后，进一步与20 μmol/L NaHS 在37 ℃孵育50 min的荧光显微镜图像，比例尺：20 μm[86]a.红色表示HCT-116细胞质区域被染料71染色(λex=550nm);b.HCT-116细胞质无色区域为染料71与NaHS (λex=550 nm);c.红色表示CT-26细胞质区域被染料71染色(λex=550 nm);d.CT-26细胞质无色区域为染料71与NaHS (λex=550 nm)

4.10 1,7位含萘基aza-BODIPY染料的合成及其在单重态产氧中的应用

利用重原子效应，通过增加S1→T1跃迁，可以提高单重态氧的生成效率[87]。近红外吸收染料73Br和74Br(λabs=705 nm)光照下可以产生单重态氧(图28)[88]。由于重原子效应，与73H和74H相比，73Br和74Br荧光均非常弱。与相应的母体aza-BODIPY74H(λabs=718 nm)相比，74Br的最大吸收蓝移至698 nm。近红外染料73和74具有高消光系数。与母体aza-BODIPY相比，二溴取代的aza-BODIPY作为PS产生单重态氧，更为有效。在此过程中，没有观察到含萘基的aza-BODIPY染料被光漂白。

图28 萘取代的aza-BODIPY染料

4.11 新型5，6，5，6-四环吡嗪/吡咯稠合不对称双(BF2)荧光染料BOPYPY的合成、性能及应用

Jiao等[89]报道了含有吡咯和N-杂芳烃衍生物(BOPPY)的不对称双(BF2)荧光团的新结构。2019年，我们首次报道了5,6,5,6-四环吡嗪/吡咯稠合的不对称双(BF2)荧光染料(BOPYPY)(图29)[90]，BOPYPY75在490 nm、522 nm处发射，与典型的BODIPY染料相比，具有大的斯托克斯位移(79 nm)。与75相比，BOPYPY76～80通过相应吡咯的π-共轭的延伸，具有长波长吸收(λabs=498～546 nm)，并且它们的发射甚至达到红色区域(λem=560～610 nm)。此外，BOPYPY76～80具有高摩尔消光系数、高荧光量子产率和更大的斯托克斯位移(96～106 nm)。BOPYPY75与4-二甲基氨基苯甲醛的Knoevenagel反应，能够平稳地生成带二甲基氨基取代的染料81(图30)，其可作为pH响应性荧光传感器检测酸值。

图29 荧光染料BOPYPY 75～80

图30 pH荧光分子探针81

4.12 BODIPY/aza-BODIPY在光扳机方面的应用

为了对活细胞中的CO进行选择性成像，Chang及其同事使用了钯配合物82(图31)[91]。由于钯的重原子效应，82的荧光被猝灭。与CO反应后，钯原子从BODIPY中释放出来，导致荧光恢复，荧光开启，对CO具有选择性，并且几乎不受ROS或活性氮(RNS)的影响。

图31 基于钯的重原子效应淬灭的CO响应探针

通过环二氧甲烷中间体进行的苯酚分子内氧化可用于检测ONOO-(图32)[92,93]。通过PeT控制，化合物83与ONOO-反应产生荧光，开启响应[94]。

图32 基于ONOO-检测的BODIPY探针

5 结论

尽管Lukyanets的方法很容易实现且在商业上可行，但合成的aza-BODIPY结构单一，其功能很少被报道。O’Shea的方法占据了合成aza-BODIPY的主要位置[95]。而通过Carreira方法合成的具有更长波长的芳基稠合的aza-BODIPY及其应用，未来值得提倡和期待。