靳三针通过调控钙结合蛋白PV、CB表达抑制脑卒中肢体痉挛大鼠肌张力增高的机制研究∗

黄秀容 张子强 方宣琼 袁 青

（1.广东省深圳市人民医院，广东 深圳 518001；2.广州中医药大学，广东 广州 510405）

脑卒中（Stroke）是一种常见脑血管疾病，又称中风或脑血管意外，发病率高、复发率高，致残率及致死率亦高，已成为导致全球患者死亡的第二大原因［1］。该病好发于40岁以上人群，男性多于女性，是我国成年人残疾的首要原因，约50%～83%患者存在不同程度肢体瘫痪，而脑卒中痉挛状态是以上残疾者中重要并发症之一，严重影响患者独立生活能力及生活质量［2-3］。中医学将痉挛归为“筋病”“痉证”范畴，与阴阳失调、筋脉失养等有关［4］。针灸是临床治疗脑卒中后肢体痉挛常用方法，操作方便、价格低廉，患者接受度高且无副作用。靳三针疗法是一种特定配穴针刺疗法，可促进弱智儿童、脑瘫及缺血性脑卒中患者大脑发育，改善其适应性行为，但靳三针疗法对脑卒中后痉挛患者肌张力的降低是否有影响及其作用机制尚不明确［5-6］。现代医学认为，脑卒中后肢体痉挛可能与脊髓上神经通路反射亢进有关，钙结合蛋白小白蛋白（PV）、钙结合蛋白D（CB）与Ca2+亲和力很强，在脑内分布广泛，可抵抗脑内Ca2+超载，与神经元兴奋性传递有关，而肌张力由运动神经元产生［7-8］。基于此，本研究拟通过探究靳三针对脑卒中肢体痉挛大鼠肌张力及PV、CB蛋白表达影响，以期揭示靳三针治疗作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

32只成年健康6周龄SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量180～200 g，购自南京君科生物工程有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2018-0021，使用许可证号：SYXK（苏）2018-0047，合格证号：0019012806。大鼠均于（23±2）℃、（50±10）%湿度、12 h/12 h（光照/黑暗环境），自由饮水饮食条件下适应性饲养1周。本实验经广州中医药大学和深圳市人民医院伦理委员会批准。

1.2 试药与仪器

蛋白抽提试剂盒（货号：P0028）、BCA蛋白定量试剂盒（货号：P0010S）购自上海碧云天有限公司；鼠源一抗anti-PV（货号：PA1-933）、anti-GAPDH（货号：AM4300），兔源anti-CB（货号：PA5-85669），二抗羊抗鼠IgG（货号：A-11001）、羊抗兔IgG（货号：A-11008）均购自美国Invitrogen公司。MODEL550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司；BL-420F型生理记录仪购自成都泰盟软件有限公司；华佗牌一次性无菌针（编号：41.12270009，注册证号：苏械注准20162270970号，规格：直径0.25 mm，长13 mm）购自苏州医疗用品厂有限公司；中动脉栓塞（MCAO）线栓（型号：503356PK5Re）购自天津敏学科技有限公司。

1.3 造模及分组

参照改良Zea Longa法［9］，随机选取22只SD大鼠采用2%异戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）麻醉后，切开皮肤，分离颈总动脉，颈内、颈外动脉，结扎后插入MCAO线栓制备右侧大脑MCAO肢体痉挛模型。造模后连续3 d腹腔注射2万U庆大霉素防止术后感染。术后注射速尿（0.1 mg/kg）防止脑水肿，并采用保温灯照射保证术后大鼠肛温37℃左右。造模后，采用Bederson评分标准［10］对神经功能进行评分，≥1分表示脑卒中模型制备成功；造模后第3日采用改良Ashworth标准［11］对肌张力情况进行分级，≥1级表示大鼠存在肌张力增高、被动活动困难、共济失调等痉挛表现。本研究以Bederson评分1～3分且Ashworth分级≥1级作为脑卒中肢体痉挛模型制备成功的标准，共2只死亡，造模成功20只，随机分为模型组和靳三针组，每组10只。另取10只大鼠为假手术组，仅切开皮肤，分离颈总动脉，颈内、颈外动脉，不插入MCAO线栓，直接消毒缝合。术后处理同模型组。

1.4 干预方法

于造模手术后3 d开始进行靳三针治疗。参照李忠仁主编《实验针灸学》［12］及华兴邦等［13］报道人与动物骨度类比取穴，患侧颞三针：第一针，耳尖直上发际50 mm处；与第一针同水平处向前25 mm为第二针，向后25 mm为第三针。采用捻针手法进针，快速捻转2～3 min，颞三针先垂直刺入皮下，达帽状腱膜下后沿皮平刺；足三里直刺进针；鼠蹊于腹股沟动脉搏动处外侧进针；阳陵泉透刺进针；三阴交沿胫骨后缘悬刺进针。针刺后留针30 min，每天1次，治疗6 d。

1.5 观察指标

1.5.1 Bederson神经功能缺损程度评分 于造模术后1 d、3 d（治疗前）、9 d（治疗后）采用双盲法参照Bederson评分标准［10］对3组大鼠进行神经功能缺损程度评分：轻提大鼠尾巴远离桌面10 cm，轻推大鼠肩膀，直至前肢滑动数厘米，并选择不同方向重复数次。正常大鼠2个前爪向桌面方向伸直，在不同方向抵抗力一致，而脑损伤大鼠偏瘫侧前肢屈曲。无神经功能缺损记为0分；前肢屈曲，提尾实验阳性记为1分；侧推抵抗力下降，伴前肢屈曲，无转圈行为记为2分；伴自发性转圈行为、自由运动时向偏瘫侧划圈记为3分。

1.5.2 电生理描记法测定肌张力 分别于术后3 d（治疗前）、9 d（治疗后）测定各组大鼠间接肌张力，各组大鼠浅度全身麻醉后采用BL-420F型生理记录仪测定间接肌张力［14］，将电极一端插入大鼠尾部，另一端于右后肢肱四头肌，并与其下端系一根顺应性棉线，连接于生理记录仪，给予0.5 g后负荷，定时以3 mA，30 s刺激大鼠肱四头肌，记录产生的电信号，即间接反映肌张力，用以表示大鼠肢体痉挛程度。肌张力越高，刺激痉挛机体被动运动幅度越小，对棉线牵拉力则越小，描记出来电信号越低，反之亦然。

1.5.3 Feeney平衡木评分［15］于术后 1 d、3 d（治疗前）、9 d（治疗后）采用双盲法对各组大鼠进行评分。让大鼠在距离地面10 cm高度的80 cm×2.5 cm长方形平衡木板上行走，测定其运动功能。大鼠可跳上平衡木，行走时不会跌倒记为0分；跌倒机会小于50%记为1分，跌倒机会大于50%记为2分；大鼠在健侧后肢协助下能跳上平衡木，但偏瘫后肢不能协助肢体前移记为3分；人为放置大鼠于平衡木上，大鼠可坐在平衡木上但不能行走记为4分；将大鼠放置于平衡木上大鼠无法正常坐立，会掉下平衡木记为5分。评分越高，运动能力越差。

1.5.4 Western blotting检测大鼠脑干组织中钙结合蛋白PV、CB表达 其他指标观察结束后，各组大鼠用2%异戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）麻醉后剪断股动脉处死，取适量脑干组织于冻存管中，立即置于液氮中保存备用。采用蛋白抽提试剂盒提取脑干组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，置于-80℃保存备用。取60 mg蛋白样品，80 mV电压下6%SDS-PAGE电泳2 h，250 mA下PVDF膜转膜1 h，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，PBS稀释一抗anti-PV（0.1 mg/mL）、anti-CB（稀释比1∶500）、anti-GAPDH抗体（稀释比1∶500）4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，二抗 IgG（1∶5 000）室温孵育1.5 h，按上述方法洗膜，用免疫印记化学发光试剂（ECL）显色，数字化多功能图像增强化学发光系统曝片，观察并分析结果。

1.6 统计学处理

应用SPSS25.0统计软件。计量资料以（）表示，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较

见表1。术后1 d、3 d（治疗前）、9 d（治疗后），假手术组无神经功能功能缺损症状，与假手术组比较，模型组、靳三针组大鼠神经功能缺损程度评分显著升高（P＜0.05）；术后9 d（治疗后），与模型组比较，靳三针组大鼠神经功能缺损程度评分显著降低（P＜0.05）；与术后3 d（治疗前）比较，术后9 d（治疗后）靳三针组大鼠神经功能缺损程度评分显著降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

与本组术后1 d比较，∗P＜0.05；与本组术后3 d（治疗前）比较，#P＜0.05；与假手术组同时期比较，△P＜0.05；与模型组同时期比较，▲P＜0.05。下同

组别假手术组模型组靳三针组n 10 10 10术后1 d 0.00±0.00 2.19±0.43△2.06±0.42△术后3 d（治疗前）0.00±0.00 2.01±0.39△1.96±0.38△术后9 d（治疗后）0.00±0.00 1.68±0.33*△0.67±0.15*#△▲

2.2 各组大鼠电生理描记间接肌张力结果比较

见表2。术后3 d（治疗前）、术后9 d（治疗后），与假手术组比较，模型组、靳三针组大鼠间接肌张力显著降低（P＜0.05）；术后9 d（治疗后），与模型组比较，靳三针组大鼠间接肌张力显著升高（P＜0.05）；与术后3 d（治疗前）比较，术后9 d（治疗后）靳三针组大鼠间接肌张力显著升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠电生理描记间接肌张力结果比较（±s）

表2 各组大鼠电生理描记间接肌张力结果比较（±s）

组别假手术组模型组靳三针组n 10 10 10术后3 d（治疗前）7.68±1.23 4.11±0.79△3.97±0.68△术后9 d（治疗后）7.51±1.34 4.28±0.73△5.64±0.82#△▲

2.3 各组大鼠运动功能比较

见表3。术后1 d、3 d（治疗前）、9 d（治疗后），与假手术组比较，模型组、靳三针组大鼠Feeney平衡木行走评分显著升高（P＜0.05）；术后9 d（治疗后），与模型组比较，靳三针组大鼠Feeney平衡木行走评分显著降低（P＜0.05）；与术后1 d、3 d（治疗前）比较，术后9 d（治疗后）靳三针组大鼠Feeney平衡木行走评分显著较低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠Feeney平衡木行走评分比较（分，±s）

组 别n 术后1 d 术后3 d（治疗前）术后9 d（治疗后）10 10 10假手术组模型组靳三针组0.00±0.00 4.12±0.81△3.87±0.74△0.00±0.00 3.53±0.69△3.16±0.65△0.00±0.00 2.71±0.54△1.69±0.35*#△▲

2.4 各组大鼠脑干组织中钙结合蛋白PV、CB表达水平比较

见表4，图1。术后3 d（治疗前）、术后9 d（治疗后），与假手术组比较，模型组、靳三针组大鼠脑干组织中钙结合蛋白PV、CB表达水平显著降低（P＜0.05）；术后9 d（治疗后），与模型组比较，靳三针组大鼠脑干组织中钙结合蛋白PV、CB表达水平显著升高（P＜0.05）；与术后3 d（治疗前）比较，术后9 d（治疗后）靳三针组大鼠脑干组织中钙结合蛋白PV、CB表达水平显著升高（P＜0.05）。

表4 各组大鼠脑干组织中钙结合蛋白PV、CB表达水平比较（±s）

表4 各组大鼠脑干组织中钙结合蛋白PV、CB表达水平比较（±s）

组别假手术组（n=10）模型组（n=10）靳三针组（n=10）时间术后3 d（治疗前）术后9 d（治疗后）术后3 d（治疗前）术后9 d（治疗后）术后3 d（治疗前）术后9 d（治疗后）PV 1.12±0.11 1.13±0.10 0.27±0.04△0.19±0.03△0.29±0.05△0.71±0.09#△▲CB 1.09±0.12 1.08±0.11 0.28±0.06△0.19±0.04△0.17±0.04#△0.93±0.10#△▲

图1 各组大鼠脑干组织中PV、CB蛋白表达

3 讨 论

目前多采用MACO线栓法制备脑卒中模型，该法稳定性好，可使缺血时间和再灌注具有可控性，被认为是脑卒中局灶性缺血标准模型［16］。本研究中采用MACO法造模，共计20只大鼠Bederson评分1～3分且Ashworth分级≥1级，表明脑卒中肢体痉挛大鼠模型制备成功，用于后续实验。脑卒中多伴随肢体痉挛并发症，多项研究采用大鼠肌张力反映其肢体痉挛状态［14，17］。本研究发现，与假手术组比较，模型组、靳三针组大鼠神经功能缺损程度评分、Feeney平衡木行走评分显著增加，间接肌张力显著降低，提示本研究中模型大鼠存在神经功能损伤、运动能力降低、肢体痉挛等病症。

痉挛属中医“筋病”“痉证”范畴。据《难经·二十九难》中记载“阴跷为病，阳缓而阴急；阳跷为病，阴缓则阳急”。跷脉通于脑，中风后脑受损可致阴阳跷脉功能失衡异常，脉气不能相交，导致肢体内外侧筋肉阴阳脉气失衡，表现为拮抗肌迟缓无力，原动肌拘急痉挛，运动功能减退或丧失。又如《医贯·中风要旨》记载“其手足牵掣，口眼歪斜，乃水不荣筋，筋急而纵也”［18］。靳三针中“颞三针”可平肝潜阳，息风泻火，疏通肝胆经络气血；“足三针”取穴刺之可将胫神经分支、外侧神经密集处及腓肠神经等信息传入脊髓，再由传出神经冲动传至下肢瘫痪肌肉，产生肌肉收缩反射；“挛三针”是治疗偏瘫痉挛状态的主要穴位，注重肢体肌群阴阳穴配合互济，协调肌张力平衡，抑制痉挛［19-20］。田亮等［21］研究报道，靳三针疗法可有效改善额叶损伤大鼠执行功能和空间学习记忆力。石新涛等［6］研究报道，消栓通络颗粒联合靳三针可通过减轻患者痉挛程度、神经缺损功能，改善患者运动能力。本研究结果发现，与术后3 d（治疗前）比较，术后9 d（治疗后）靳三针组大鼠神经功能评分、运动能力评分均显著降低，间接肌张力增加，提示靳三针可有效改善脑卒中大鼠神经功能，缓解肢体痉挛状态，增加运动能力。

γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统内主要抑制性递质，GABA神经元由PV、CB及钙视网膜蛋白（CR）3种含钙结合蛋白亚群构成，与上运动神经元受损后肌张力升高关系密切［17］。毛雪莲等［15］研究报道，电针可通过增加GABA代谢改善脑卒中肢体痉挛状态，降低大鼠肌张力。伍芳等［14］研究报道，电针治疗可提高缺血性脑卒中大鼠脑干、颈膨大及腰膨大组织PV、CB蛋白表达，缓解其肢体痉挛状态。本研究结果发现，与术后3 d（治疗前）比较，术后9 d（治疗后）靳三针组大鼠脑干组织中PV、CB蛋白表达水平显著增加，提示靳三针可能通过上调脑干组织中PV、CB蛋白表达抑制脑卒中后痉挛大鼠肌张力增加，缓解其痉挛状态。

综上所述，靳三针可能通过上调钙结合蛋白PV、CB表达抑制脑卒中肢体痉挛大鼠肌张力增高，缓解其痉挛状态。但是否涉及其他代谢通路参与尚不完全清楚，有待进一步深入探究。