龙脑樟挥发油对大鼠离体颈总动脉环的作用

鲁杰 马国祥 江健 胡继川

摘要 目的：建立气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）联用分析鉴定龙脑樟挥发油（VOCC）的化学成分的方法，探讨VOCC对大鼠颈总动脉的张作用。方法：采用水蒸气蒸馏法提取，无水硫酸钠脱水-4 ℃冰箱中重结，通过GC-MS对VOCC进行成分分析，结合计算机检索对分离的化合物进行结构分析与鉴定，色谱峰面积采用归一化法计算各组分的相对含量;将大鼠颈总动脉血管环制成无内皮和含内皮2种标本，以苯肾上腺素（PE）为血管收缩剂，观察VOCC对大鼠离体血管环预收缩的作用。结果：共分离得到45个化学成分，鉴定得到相似度在90%以上的40个化合物，占总VOCC的99.86%，天然冰片的相对含量最高，占总VOCC的93.49%;VOCC能抑制PE所致的颈总动脉收缩，且无内皮依赖性，VOCC对劲总动脉血管的舒张作用呈明显剂量依赖性。结论：在本实验条件下，天然冰片得到了基线分离，此方法可用于天然冰片原料和制剂的定量分析;VOCC对PE诱导的血管收缩具有显著拮抗作用，提示其具有较好的扩血管作用。

关键词 龙脑樟;天然冰片;气相色谱-质谱;大鼠;颈总动脉血管;收缩;舒张;作用机制

Abstract Objective：To establish a gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）combined analysis method to identify the chemical constituents of Volatile Oil of Cinnamomum Camphora（VOCC），and to explore the effects of VOCC on the common carotid artery in rats.Methods：The method of our study were as follows：extracted by steam distillation，dehydrated in anhydrous sodium sulfate dehydrated in -4 ℃ refrigerator，analyzed the composition of VOCC by GC-MS，combined with computer search to analyze and identify the separated compounds.The relative content of each component was calculated by one-step method; the rat common carotid artery vascular ring was made into endothelium-free and endothelium-containing specimens，and phenylephrine（PE）was used as a vasoconstrictor to observe VOCC on role of ring pre-contraction on isolated rat blood vessels.Results：A total of 45 chemical components were isolated，and 40 compounds identified were with a similarity above 90%，accounting for 99.86% of the total VOCC.Natural borneol had the highest relative content，accounting for 93.49% of the total VOCC; VOCC could inhibit PE common carotid artery contracted without endothelium dependence，and the vasodilator effect of VOCC on the common arterial artery was obviously dose-dependent.Conclusion：Under this experimental condition，natural borneol is separated from the baseline.This method can be used for quantitative analysis of natural borneol raw materials and preparations.VOCC has a significant antagonistic effects on PE-induced vasoconstriction，suggesting that it has a good vasodilator effects.

Keywords Cinnamomum Camphora; Borneol; GC-MS; Rats; Common Carotid Artery; Systole; diastole; Action mechanism

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.016

龙脑樟（Cinnamomum camphora chvar.Borneol）是上世纪八十年代在湖南新晃发现的，目前该种被认为是樟[Cinnamomum camphora（L.）Presl]的一种化学型[1]，其新鲜枝、叶提取得到的挥发油中富含右旋龙脑，是目前天然冰片的最佳植物原料。且自古就是一種高级香料，被广泛应用于医药、香料、化妆品、食品工业等行业[2-3]。

天然冰片又叫天然右旋龙脑，其气清香，味辛、凉，归心、脾、肺经，具有通诸窍、消肿止痛、散郁火、去臀明目、开窍醒神等功效[4-5]。天然冰片在我国有2 000多年的用药历史，是安宫牛黄丸、六神丸、丹参滴丸等中华国药之瑰宝的主要组分，其作为佐药治疗心血管疾病在临床上广泛应用[6-8]，但有关VOCC对离体血管的作用及机制尚未见报道。

历史上天然冰片主要是来自于龙脑香科龙脑香（Dryobalanops aromatica Gaertn.f.）树的树脂提取物，该植物主要分布在印尼的苏门答腊群岛，我国长期依赖进口。自我国发现龙脑樟后，其已成为我国天然冰片的主要植物来源。由于龙脑樟地理分布范围较广，在我国长江流域及华南地区均有零星分布，且其呈化学多型性，导致种内形成了丰富的遗传变异，不同产地的龙脑樟树种品质以及龙脑含量均存在较大的差异[9]，这直接影响到以天然冰片入药的制剂质量的稳定性。因此本实验采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、计算机联用的方法对从湖南引种栽培的VOCC化学成分进行了分析，为控制天然冰片的质量提供理论依据;通过VOCC作用于大鼠离体颈总动脉环，观察其对颈动脉血管的扩张作用，为进一进探讨其作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD成年健康SPF级大鼠，雌雄各半，体质量（240±10）g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（苏）2011-0003，常规实验室恒温恒湿环境饲养，自由饮食，12 h/12 h昼夜交替。

1.1.2 药物 龙脑樟新鲜枝、叶于2018年5月采自湖南省新晃龙脑开发有限责任公司龙脑樟种植基地，并由对材料进行分类学鉴定为樟科龙脑樟（Cinnamomum camphora chvar.Borneol）。

1.1.3 试剂与仪器 气质联用仪（美国安捷伦公司，型号：Agilent 7890B GC-5977A MS），全自动旋转蒸发仪（上海摩速科学器材有限公司，型号：SGW-1），台式高速离心机（美国ThermoFisher公司，型号：Heraeus Mutifuge XIR），超纯水机（上海必能信有限公司，型号：D-1006-D2），100～1 000 μL、20～200 μL、5～50 μL，移液枪（德国BRAND公司，型号：M8-50），四腔器官浴槽系统（成都仪器厂，型号：SQG-4型），生物信号采集处理系统（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，型号：DB088）。苯肾上腺素（上海禾丰制药有限公司，批号：080311），乙酰胆碱（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：080424），酚妥拉明注射液（上海旭东海普药业有限公司，国药准字H31020589），硝苯地平（山西云鹏制药有限公司，国药准字H14020798），K-H营养液（国药集团化学试剂有限公司，批号：080114），本实验所用提取分离试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 参照文献方法[10]，制备保留内皮和去内皮血管环标本。大鼠处死后迅速取出双侧颈动脉，预冷后置于K-H液中（恒温37 ℃，95% O2+5%CO2混合气体饱和液），去除血管上的脂肪及结缔组织，将动脉剪成3 mm左右的环，制备成保留内皮血管环备用;取部分颈动脉环用棉签插入血管腔轻轻旋转并前后移动2～3次，制备成去内皮血管环标本备用。血管环制备好后悬挂于浴槽内，血管一端固定于浴槽内，另一端与张力换能器连接，采用生物信号采集系统采集和记录张力的变化。浴槽内K-H液保持恒温37 ℃、持续通入95%O2+5% CO2的混合气体，共平衡60 min，平衡结束后，按实验要求进行分组处理，平衡期间每15 min换恒温37 ℃的K-H液1次。

1.2.2 给药方法 采用水蒸气蒸馏法提取。称取新鲜龙脑樟枝、叶200 g剪碎后置于VOCC提取装置中，加重蒸水2 L，蒸馏提取2 h，提取物用无水硫酸钠脱水后置于-4 ℃冰箱中重结晶24 h后称重，用乙酸乙醋溶解并转移至容量瓶中定容、备用。

1.2.3 检测指标与方法 GC-MS测试分析：VOCC经GC-MS联用仪分析鉴定，检出的峰得到GC-MS指纹色谱图，对应的质谱图经美国NIST 05标准质谱库检索及人工解析确定各化学成分，按峰面积归一化法求得各化学成分的相对质量百分含量。GC-MS条件：色谱柱DB-624毛细管柱30 m×0.25 mm×1.40 μm）;柱温起始温度60 ℃恒温3 min后以20 ℃/min速率升温至220 ℃，恒温5 min后以5 ℃/min速率升温至280 ℃，恒温4 min，流速1 mL/min，进样口温度280 ℃，进样量1 μL;电离方式EI、离子源温度250 ℃，扫描质量范围：50～400 amu全扫描，溶剂切除时间3.5 min。血管环内皮完整性检验：将制备好的保留内皮和去内皮血管环标本用90 mmol/L KCl刺激血管环20 min后用KH液洗脱，重复3次，以诱发血管最大张力，待血管收缩到基础状态并稳定后，用PE 1×10-6 mol/L预收缩动脉环，待收缩稳定后，加入Ach 10-5 mol/L，若加入Ach后使血管环舒张、且血管舒张达50%以上，表明内皮完整;反之，则认为内皮已去除。VOCC对PE致血管环舒张的作用：取上述符合要求的内皮完整的血管环标本，待血管环收缩稳定后，按随机数字表法分为空白对照组、阳性药对照组（PHE组）、药物组高（1.80 mmol/L）、中（1.20 mmol/L）、低剂量组（0.6 mmol/L）。各组浴槽中加入终浓度为1×10-6 mol/l的PE刺激血管环收缩，等血管环收缩张力稳定后进行加药实验。药物组：精密称取2.0 gVOCC溶于无水乙醇中，制成终浓度为0.60、1.20、1.80 mmol/LVOCC混合液，分别取400 μL加入到浴槽中;PHE组加入400 μL PHE溶液（濃度为8×10-6μmol/L）;空白对照组往浴槽中加入400 μL无水乙醇（浓度为4.45 mmol/L）。记录各组给药5 min后的舒张率，计算各组舒张率[11]。舒张率=（收缩最大张力-舒张最小张力）/（收缩最大张力-初始张力）×100%。VOCC扩血管活性的量效评价：按以上方法，分别取400 μL终浓度为0.4、0.60、0.8、1.0、1.20、1.4、1.6、1.80 mmol/L加入到浴槽中，观察记录血管收缩情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验;计数资料用例（%）表示，进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VOCC的提取 重结晶后所得的白色结晶体即为VOCC。200 g的新鲜龙脑樟枝、叶得挥发油2.72 g。经公式：VOCC提取率（%）=VOCC的质量/龙脑樟枝、叶的质量×100%，计算出龙脑樟提取率为1.36%（w/w）。

2.2 GC-MS指纹色谱图 按“2.2”项的GC-MS条件对VOCC进行分析，得到其总离子流图，结果见图1。

2.3 VOCC的化学成分 VOCC经GC-MS分析得到45个化合物，通过鉴定得到相似度在90%以上的40个化合物，占总VOCC的99.86%，其主要成分为天然冰片，占总成分的93.49%，其次为：樟脑占总VOCC的1.16%、β-石竹烯占总VOCC的0.73%、α-石竹烯占总VOCC的0.72%。结果显示，VOCC中天然冰片的含量非常高。所鉴定的VOCC中的化学成分及所得的各化学成分在VOCC中的相对峰面积百分含量见表1。

2.4 VOCC对PE所致血管环收缩的作用 经阳性药PHE和不同剂量药物作用后，含内皮和去内皮各组的血管环张力均不同程度降低，与空白对照组比较，除药物低剂量外，PHE组和药物高、中剂量组的血管舒张率显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。与PHE组比较，药物高、中剂量组的血管舒张率差异无统计学意义（P>0.01）。提示VOCC能抑制PE所致的颈总动脉收缩，且无内皮依赖性。结果见表2、表3。

2.4 VOCC扩血管活性的量效曲线 VOCC对劲总动脉血管的舒张作用呈明显剂量依赖性，在0.1～1.5 mmol/L范围内时，随着给药浓度增加，VOCC扩血管作用呈明显增长趋势;在1.5～2.1 mmol/L范围内，随着给药浓度增加，其扩血管作用增加较缓;当给药浓度为1.5 mmol/L时，舒张率最大可达70.46%。见图2。

3 讨论

在VOCC提取过程中，我们采取水蒸气蒸馏法进行提取，经乙醚萃取后所得VOCC经GC-MS检测，发现所得VOCC中天然冰片的含量与未经乙醚萃取组含量差异无统计学意义[12-14]。因此，本实验VOCC提取后直接采用无水硫酸钠脱水后重结晶，所得VOCC中天然冰片含量高，此方法可节约提取时间、降低生产成本，可有效应用于天然冰片的工业化生产中。

龙脑樟中天然冰片的提取及含量测定的色谱方法研究较多，但目前文献报道所得的天然冰片的含量均在60%以下。本研究所采用的VOCC的提取方法得油率高（1.36%）;所采用GC-MS色谱分析鉴定方法，鉴定出VOCC含有40种成分，均为萜类成分[15];本研究中采用的GC条件使天然冰片得到了基线分离，其相对含量高达93.49%%。提示本提取、分析的工艺方法可用于天然冰片原料和制剂的定量分析。

天然冰片的主要来源植物為龙脑樟，龙脑樟挥发油中的主要成分为天热冰片[16]。天然冰片属于名贵中草药材，在《本草纲目》中提到：“龙脑者，以白莹如冰及作梅花片者为良，故俗呼为冰片脑”。天然冰片具有开窍醒神、清热止痛的功效[17-18]。现代药理研究证实，天然冰片具有抗病原微生物，抗炎镇痛的作用，并且可提高血管壁通透性的[19]。PE可诱导血管收缩，其诱导血管收缩主要通过激活血管平滑肌α受体，打开慢钙通道，使细胞外钙内流致胞质中钙浓度提高，收缩力增强，从而达到血管收缩的作用[20]。本实验结果表明，VOCC中高剂量组均能明显拮抗PE所致的血管收缩，无内皮依赖性，提示了VOCC诱发血管舒张可能与受体依赖性钙通道和细胞内Ca2+释放的抑制有关。研究结果显示，VOCC对颈总动脉血管具有显著的舒张作用，且呈明显的剂量依赖性，这可能是因为天热冰片具有对钙拮抗作用，可直接作用于血管平滑肌，抑制Ca2+的释放，从而降低细胞内Ca2+的浓度水平，进而使血管平滑肌舒张。

综上所述，采用GC-MS法对从湖南引种栽培的VOCC化学成分进行了分析，对于充分提高龙脑樟植物资源的利用率有着十分重要的意义，VOCC具有扩血管作用，可为其用于临床治疗心脑血管疾病提供了基础。

参考文献

[1]Silan Chena，Tiefeng Zhenga，Chaolin Yea，et al.Algicida properties of extracts from Cinnamomum camphora fresh leaves and their main compounds[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2018，163（15）：594-603.

[2]Chongqing Wang，Hui Wang.Carboxyl functionalized Cinnamomum camphora for removal of heavy metals from synthetic wastewater-contribution to sustainability in agroforestry[J].Journal of Cleaner Production，2018，184（20），921-928.

[3]谢佩吾，何波祥，汪迎利，等.龙脑樟开发利用产业的标准化研究[J].林业与环境科学，2019，35（1）：94-100.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：59.

[5]汪宏锦，吴俊杰，薛强，等.冰片对血脑屏障通透性的双向调节作用影响因素及机制探讨[J].中国中药杂志，2017，42（11）：2200-2207.

[6]郭军洽，张荣，段美美，等.天然冰片对甲氨蝶呤透过血肿瘤屏障的影响[J].中药新药与临床药理，2015，26（1）：73-77.

[7]Zaizhi Liu，Baoqin Deng，Shuailan Li，et al.Optimization of solvent-free microwave assisted extraction of essential oil from Cinnamomum camphora leaves[J].Industrial Crops & Products，2018，124（15）353-362.

[8]王建，曲晓兰，范存东，等.冰片配伍红花对大鼠大脑中动脉脑缺血的影响及其机制研究[J].中国医院药学杂志，2018，38（23）：2410-2414.

[9]欧阳少林，赵小宁，李楚文，等，龙脑樟果实挥发油成分气相色谱-质谱分析[J].中国中医药信息杂志，2013，20（11）：58-60.

[10]潘媛，彭成，江虹雨，等.氢溴酸樟柳碱对离体大鼠颈总动脉的作用及机制研究[J].四川动物，2018，37（6）：660-666.

[11]张双伟，张军，刘宁宁，等.异紫花前胡内酯对离体大鼠胸主动脉的舒张作用及机制[J].中国新药与临床药理，2016，27（5）：637-643.

[12]荔淑楠，王引权，徐名刷，等，气相色谱-质谱联用同时测定龙脑樟鲜叶中右旋龙脑、樟脑及异龙脑的含量[J].甘肃中医药大学学报，2018，35（5）：32-36.

[13]丁雄，苏健裕，石磊，等.龙脑樟鮮叶挥发油成分及其抗菌活性的研究[J].食品工业科技，2012，33（18）：167-171.

[14]黄慧莲，林涛，熊梅，等.龙脑樟枝叶中挥发油化学成分GC-MS分析[J].世界中医药，2012，7（5）：453-455.

[15]黄慧莲，林涛，熊梅，等.龙脑樟枝叶中挥发油化学成分GC-MS分析[J].世界中医药，2012，07（5）：453-455.

[16]刘斌，李祥兰，王晓晓，等.气相色谱法同时测定复方丹参片中樟脑残留量及冰片含量[J].中国药业，2019，28（16）：32-34.

[17]唐莉，陈紫娟，郭庆，等.龙脑樟叶片中天然冰片的提取及其清除DPPH自由基作用的研究[J].湖南城市学院学报：自然科学版，2018，27（3）：64-68.

[18]吴俊杰，汪宏锦，杨帅，等.冰片对梓醇及葛根素透过局灶性脑缺血模型大鼠血脑屏障作用的研究[J].中国中药杂志，2016，41（21）：3988-3995.

[19]邢燕梅，闫晓宁，郭军洽，等.冰片对血肿瘤屏障通透性的影响及机制[J].中国中西医结合杂志，2016，36（6）：696-702.

[20]杜珍，谢学渊，张沂.硝苯地平对氯化钾、去甲肾上腺素及内皮素诱导离体大鼠血管收缩的影响[J].海军医学杂志，2013，34（1）：25-28.

（2019-03-25收稿 责任编辑：王明）