基于超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱质谱的胃复春片化学成分研究

周丹丹 邹秦文 林瑞超

摘要 目的：基于超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）技术对胃复春片的物质基础进行了全面的研究，对主要化学成分进行快速鉴定。方法：采用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），以0.05%甲酸水-乙腈为流动相的梯度洗脱进行分离。质谱采用正、负离子检测模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描功能（Full MS/dd MS2）采集数据。通过化合物的最大紫外吸收波长、精确相对分子质量及二级碎片离子信息，与对照品的保留时间、mzVault 2.0质谱数据库及相关文献报道进行比对，鉴定胃复春片的主要化学成分。结果：共鉴定出164种化学成分，其中包括人参皂苷类42个、黄酮类97个、二萜类19个、其他6个。结论：UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术能够快速、准确、较全面地鉴定胃复春片中化学成分，为明确药效物质基础研究及提升质量标准提供了理论依据。

关键词 胃复春片;化学成分;UPLC-Q-Orbitrap HRMS;人参皂苷;黄酮;二萜

Abstract Objective：Based on ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap mass spectrometry（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）technology，to thoroughly study the material basis of Weifuchun Tablets，and to quickly identify the main chemical components.Methods：The analysis was performed on a Thermo Hypersil GOLD C18 column（150 mm×4.6 mm，3 μm）.The mobile phase comprised of water containing 0.05% formic acid and acetonitrile was used for gradient elution.Mass spectrometry adopts positive and negative ion detection mode，full scan and automatic trigger secondary mass spectrometry scan function（Full MS/dd MS2）to collect data.By comparing the compound′s maximum ultraviolet absorption wavelength，accurate relative molecular mass and secondary fragment ion information with the reference substance retention time，mzVault 2.0 mass spectrometry database and related literature reports，the main chemical components of Weifuchun tablets were identified.Results：A total of 164 chemical constituents including 42 ginsenosides，97 flavonoids，19 diterpenoids and 6 other compounds，were identified.Conclusion：UPLC-Q-Orbitrap HRMS technology can quickly，accurately，and comprehensively identify the chemical composition of Weifuchun tablets，which provides a theoretical basis for clarifying the basic research of drug efficacy and improving quality standards.

Keywords Weifuchun Tablet; Chemical Constituents; UPLC-Q-Orbitrap HRMS; Ginsenosides; Flavonoids; Diterpenoids

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.001

胃复春片收载于《中华人民共和国药典》[1]2015年版一部，由红参、香茶菜、麸炒枳壳3味中药组成，临床上主要用于慢性萎缩性胃炎、胃癌前期病变、浅表性胃炎、胃十二指肠溃疡的治疗[2]。中药复方的化学成分研究有助于明确中药药效物质基础，是提升质量标准的基础，具有十分重要的意义。目前，胃复春片中化学成分研究的报道较少。钟静华[3]采用HPLC-DAD-ESI-MSn以及HPLC/Q-TOF-MS技术对胃复春片进行分析，共鉴定出60个化学成分，初步明确了其化学物质基础。超高效液相色谱串联高分辨质谱技术具有多种质谱扫描方式，其高灵敏度、高分辨率及高质量准确度等特点，能够实现对复杂的中药复方中化学成分的筛查、识别和快速鉴定[4-5]。本研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱，通过化合物的最大紫外吸收波长、精确相对分子质量及二级碎片离子信息，与对照品的保留时间和mzVault 2.0质谱数据库信息进行匹配并参考相关的文献报道，共鉴定出胃复春片中164个化学成分。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱仪（配有二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、自动控温箱）通过HESI离子源与Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪链接，数据处理及采集软件为Xcalibur 4.2（赛默飞世尔科技公司，美国，型号：UltiMate 3000-Q-Orbitrap）;电子天平（梅特勒-托多利仪器（上海）有限公司，型号：MS204TS/02）;超声波清洗仪（Elma公司，德国，型号：P120H）：Milli-Q型超纯水（Millipore公司，美国，型号：ADVANTAGE A10）。

1.2 试剂

对照品柚皮苷（批号：110722-201815）、橙皮苷（批号：110721-201818）、冬凌草甲素（批号：111721-201704）、人参皂苷Rb1（批号：110704-202028）、人参皂苷Rg1（批號：110703-201933）、20（S）-人参皂苷Rg2（批号：111779-200801）、人参皂苷Re（批号：110754-202028）、人参皂苷Rd（批号：111818-201603）、20（S）-人参皂苷Rg3（批号：110804-201504）均购自中国食品药品检定研究院。人参皂苷Rh4（批号：174721-08-5）、人参皂苷Rg5（批号：186763-78-0）、人参皂苷Rk1（批号：494753-69-4）、人参皂苷Rk3（批号：364779-15-7）购自上海诗丹德生物技术有限公司;乙腈为HPLC级（美国Honeywell公司），甲酸为LC-MS级（美国Fisher Scientific公司），其他为分析纯（上海泰坦科技股份有限公司）。

1.3 分析样品

胃复春片（批号：19066109）为杭州胡庆余堂药业有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）;柱温：30 ℃;流速：0.3 mL/min;进样体积：5 μL;DAD检测190～400 nm。流动相为0.05%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序如下：0～6 min，5%B→20%B;6～12 min，20%B;12～20 min，20%B→30%B;20～28 min，30%B→50%B;28～35 min，50%B→95%B;35～41 min，95%B→5%B。

质谱条件：HESI离子源，正负离子扫描。鞘气体积流量40 L/min;辅助气体积流量10 L/min;喷雾电压3.5 kV;离子传输管温度320 ℃;辅助气温度350 ℃;扫描模式：Full MS/dd-MS2;正离子模式下一级扫描范围m/z 150～1 500，负离子模式下一级扫描范围m/z 100～1 500，分辨率70 000;AGC target为106，最大注入时间为100 ms，顶点触发前五强的离子做MS2;二级扫描分辨率17 500，AGC target为105，最大注入时间为50 ms，Stepped NCE为10%、20%、30%。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷、橙皮苷、冬凌草甲素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rg1、20（S）-人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、20（S）-人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rk3对照品适量，加甲醇溶解制成浓度约为50 μg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取胃复春片20片，除去薄膜衣，研细，取约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL后，称定重量，超声（功率380 W，频率37 kHz）提取45 min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足重量。摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm滤膜，即得。

2.4 结果

采用UPLC-Q-Orbitrap高分辨质谱对胃复春片进行化学成分研究。正负离子模式下得到的总离子流（TIC）色谱图如图1。红参、枳壳和香茶菜的主要活性成分可为人参皂苷类，黄酮类和二萜类化合物。根据不同类型化合物的最大紫外吸收波长可以把色谱峰进行分类：无紫外吸收的化合物为人参皂苷类;波长在254～280 nm为黄酮及苷类;波长在220～240 nm归类为二萜类化合物。通过各类化合物的质谱裂解碎片分析、mzVault 2.0质谱数据库筛查并结合对照品以及相关文献数据对比，共鉴定出164种化学成分，包括42个人参皂苷类、97个黄酮类、19个二萜类和6个其他化合物，结果见表1。

2.4.1 人参皂苷类化合物的鉴定与分析 按照其母核骨架的不同，可以分为原人参二醇型（PPD）、原人参三醇型（PPT）、齐墩果酸型（OA）以及特殊类型（如，拟人参皂苷F11、人参皂苷Rk1）等。据文献报道[18，23]，人参皂苷在负离子模式下具有较好的质谱响应，其分子离子峰通常为[M+HCOO]-和[M-H]-。人参皂苷的糖苷键容易断裂，失去相应的中性碎片离子，如：162 Da（一分子的葡萄糖）、146 Da（一分子的鼠李糖）、132 Da（一分子的木糖或阿拉伯糖）等，最终生成苷元以及苷元上C-20位脱掉侧链后的特征碎片离子。PPD型的特征离子为m/z 459 和m/z 375;PPT型的特征离子为m/z 475和m/z 391;OA型的特征离子为m/z 569和m/z 523。以峰105为例进行详细的说明。峰105的保留时间为26.98 min，-ESI模式下的[M-H]-峰为m/z=784，连续脱去一分子鼠李糖和一分子葡萄糖生成m/z=637[M-H-Rha]-和m/z=475[M-H-Rha-Glu]-，以及苷元上C-20位脱掉侧链后的碎片离子m/z=391[M-H-Rha-Glu-C6H12]-。根据相对分子质量的实测值784.496 7及元素组成分析，推测该化合物的分子式为C42H72O13（1.09 ppm）。通过与对照品的保留时间及质谱图的比较，确定该化合物为20（S）-人参皂苷Rg2，质谱裂解途径见图2。

2.4.2 黄酮及其苷类化合物的鉴定与分析 枳壳中主要含有二氢黄酮及苷类和多甲氧基黄酮及苷类等。二氢黄酮苷类的糖苷键容易断裂，其苷元的C环容易失去CO和氧原子，易发生RDA裂解，生成特征性离子[25]。以柚皮苷为例进行详细的说明。峰40的tR为13.28 min，-ESI模式下的准分子离子峰为m/z=579[M-H]-，脱去糖链生成苷元m/z=271[M-H-Glu-Rha]-，再发生RDA裂解生成特征性碎片离子m/z=151[M-H-Glu-Rha-C8H8O]-。碎片离子m/z=459[M-H-C8H8O]-是由准分子离子峰发生RDA裂解而生成。根据相对分子质量的实测值579.171 0及元素组成分析，推测该化合物的分子式为C27H32O14（0.33 ppm）。通过与对照品的保留时间及质谱图的比较，确定该化合物为柚皮苷，质谱裂解途径见图3。

多甲氧基黄酮及苷类化合物含有多个甲氧基，其质谱裂解规律[26]主要为糖链的断裂，失去多个CH3、中性分子H2O、CO以及RDA裂解。以橘皮素为例进行详细的说明。峰148的tR为31.67 min，+ESI模式下的准分子离子峰为m/z=373[M+H]+，连续脱去3个CH3以及发生RDA裂解，分别生成m/z=358[M+H-CH3]+、m/z=343[M+H-2CH3]+、m/z=328[M+H-3CH3]+和m/z=211[M+H-3CH3-C9H8O]+。碎片离子m/z=343继续脱去一分子CO、H2O以CH3，生成m/z=315[M+H-2CH3-CO]+、m/z=297[M+H-2CH3-CO-H2O]+、m/z=297[M+H-3CH3-CO]+的碎片离子。根据相对分子质量的实测值373.128 0及元素组成分析，推测该化合物的分子式为C20H20O7（-0.43 ppm）。结合相关文献[15，17]推測该化合物为橘皮素，质谱裂解途径见图4。

2.4.3 二萜类化合物的鉴定与分析 香茶菜中的主要化学成分为二萜类化合物。以冬凌草甲素为例进行详细的说明。冬凌草甲素在C-7位为一个半缩酮、C15位为一个酮羟基和多个羟基。因此，其质谱裂解规律[14]主要为失去H2O、CO2、CO以及CH2O。峰59的保留时间为17.77 min，-ESI模式下的准分子离子峰[M-H]-为m/z=363，脱去一分子CH2O生成m/z=333[M-H-CH2O]-。[M-H]-峰连续脱去2个分子的H2O以及一分子CO和一分子CO2，产生相应的碎片离子m/z=345[M-H-H2O]-、m/z=327[M-H-2H2O]-、m/z=299[M-H-2H2O-CO]-和m/z=283[M-H-2H2O-CO2]-。此外，特征离子m/z=333连续脱去一分子H2O和一分子CO2生成m/z=315[M-H-CH2O-H2O]-和m/z=271[M-H-CH2O-H2O-CO2]-的碎片离子。根据相对分子质量的实测值363.180 9及元素组成分析，推测该化合物的分子式为C20H28O6（1.75 ppm）。通过与对照品的保留时间及质谱图的比较，确定该化合物为冬凌草甲素，质谱裂解途径见图5。

3 讨论

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap MS法对胃复春片中的主要化学成分进行快速鉴定。采用正、负离子同时扫描和Full MS/dd MS2模式采集数据。按照色谱峰的最大紫外吸收情况进行分类后，根据精确相对分子质量、二级碎片离子、质谱裂解规律、mzVault 2.0质谱数据库筛查以及相关文献报道，对未知峰进行结构解析。在缺乏对照品的情况下，共鉴定了胃复春片中164个化学成分。研究表明，人参皂苷及其代谢产物具有显著的抗肿瘤作用，尤其是人参经蒸制成红参后，转化的新成分能够加强抗肿瘤效果[27];香茶菜属二萜多具有明显的细胞毒活性、抑制肿瘤细胞生长，以及抗炎免疫作用[28];枳壳中的黄酮类成分，尤其是二氢黄酮和多甲氧基黄酮类，具有抗癌、肿瘤，抗微生物、抗炎性反应等作用[29]。上述成分构成胃复春片的复杂体系，通过多通路、多靶点、协同增效来发挥健脾益气、活血解毒之功效。建立的UPLC-Q-Orbitrap法可快速、准确地对胃复春片中的主要化学成分进行鉴定分析，从而达到整体全面地控制与评价中药复方的质量，为明确其药效物质基础提供了数据支持。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015，1174-1175.

[2]陈曦，赵亚红，张也青，等.胃复春的临床应用和现代研究进展[J].江西中医药，2016，47（9）：77-80.

[3]钟静华.基于液质联用技术的脑得生片和胃复春片物质基础辨识方法研究[D].杭州：浙江大学，2010.

[4]于泓，胡青，孙健，等.基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术的黄芪注射液中化学成分分析[J].世界中医药，2019，14（4）：809-817.

[5]孙戡平，秦昆明，李伟东，等.基于UHPLC-UV-Q-TOF-MS/MS的厚朴不同方法姜制前后化学成分定性研究[J].世界中医药，2019，14（2）：287-291.

[6]赵思宇.基于化学分类法探讨橘属植物的物质基础及枳实、枳壳不同抗炎作用[D].北京：北京中医药大学，2018.

[7]刘欣媛，嵇长久，彭文文.中药枳壳的化学成分研究[J].中国药学杂志，2018，53（19）：1627-1631.

[8]赵思宇.枳壳化学成分的研究[D].长春：吉林大学，2014.

[9]于国华，杨洪军，李俊芳，等.基于UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS技术分析枳实中的化学成分[J].中国药学杂志，2016，41（18）：3371-3378.

[10]马英华.基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析冬凌草的化学成分及冬凌草甲素体外代谢研究[D].石家庄：河北医科大学，2017.

[11]马超一，高文远，高颖，等.枳壳化学成分和代谢成分的UPLC-PAD-Q-TOF/MS分析[J].药物评价研究，2010，33（2）：110-115.

[12]邓可众，丁邑强，周斌，等.枳壳化学成分的分离与鉴定[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（14）：36-38.

[13]何英杰，刘东波，唐其，等.酸橙类中药材枳实和枳壳化学成分研究进展[J].中药材，2017，40（6）：1488-1494.

[14]田婷婷.冬凌草甲素大鼠体内代谢物的鉴定与蓝萼香茶菜中二萜类质量控制方法[D].石家庄：河北医科大学，2016.

[15]孙明谦.中药复杂成分样品的电喷雾质谱分析方法研究[D].北京：北京中医药大学，2009.

[16]丁邑强，熊英，周斌，等.枳壳中黄酮类成分的分离与鉴定[J].中国中药杂志，2015，40（12）：2352-2356.

[17]周大勇，徐青，薛兴亚，等.高效液相色谱-电喷雾质谱法测定枳壳中黄酮苷类化合物[J].分析化学，2006，34（u09）：31-35.

[18]姚长良.基于化学表征-数据挖掘的三七和相关制剂的质量控制研究[D].上海：中国科学院上海药物研究所，2018.

[19]张红霞，张丽芳，张莉，等.高效液相色谱-质谱联用法同时测定胃复春片中11种成分的含量[J].中国临床药理学杂志，2018，34（12）：1470-1474.

[20]赵静，秦振娴，彭冰，等.基于UPLC-Q-TOF MS技术的三七中皂苷类成分质谱裂解规律研究[J].质谱学报，2017，38（1）：97-108.

[21]蒋慧莲，祝明，陈勇，等.HPLC法同时测定胃复春片中蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素[J].中成药，2013，35（1）：86-89.

[22]杨武亮，陈海芳，余宝金，等.枳壳活性化学成分研究[J].中药材，2008，31（12）：1812-1815.

[23]孟青，钟艳梅，郭晓玲，等.人参中皂苷类成分的快速识别及其质谱裂解规律的初步探讨[J].中药材，2013，36（2）：240-245.

[24]邱楠楠，刘金平，苏航，等.UPLC-ESI-MS-MS分析生晒参和紫红参中皂苷类成分[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（13）：91-93.

[25]Zhou DY，Xu Q，Xue XY，et al.Identification of O-diglycosyl flavanones in Fructus aurantii by liquid chromatography with electrospray ionization and collision-induced dissociation mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2006，42（4）：441-448.

[26]Zhou DY，Chen DL，Xu Q，et al.Characterization of polymethoxylated flavones in Fructus aurantii by liquid chromatography with atmospheric pressure chemical ionization combined with tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2007，43（5）：1692-1699.

[27]罗林明，石雅宁，姜懿纳，等.人参抗肿瘤作用的有效成分及其机制[J].中草药，2017，48（3）：582-596.

[28]苏永庆，汤建，陈海生，等.蓝萼香茶菜萜类和黄酮类化合物的研究新进展[J].中国野生植物资源，2017，36（3）：50-77.

[29]陈海芳，张武岗，杨武亮，等.柑橘属常用中药黄酮类成分的研究进展[J].時珍国医国药，2008，19（12）：2863-2865.

（2020-06-10收稿 责任编辑：徐颖）