基于网络药理学探讨湿疹溻渍方治疗湿疹的作用机制

于鸿妲 陈光耀 闫英

摘要 目的：利用网络药理学方法探索湿疹溻渍方（SZTZF）治疗湿疹的物质基础与作用机制。方法：借助TCMSP数据库筛选每味药物的有效活性成分和作用靶点，基于GeneCards数据库筛选与湿疹相关的靶点，确定药物作用靶点与湿疹疾病靶点的交集基因，并进一步構建湿疹溻渍方有效成分靶点-湿疹疾病靶点的调控网络;应用STRING平台构建蛋白相互作用（PPI）网络模型;同时对二者共同靶点进行GO和KEGG通路分析。结果：共计筛选出49个有效活性成分，对应66个相关的作用靶点，其中有23个靶点与湿疹密切相关。PPI分析结果表明，白细胞介素、簇分化抗原、性激素受体及相关肿瘤蛋白在网络中占据核心地位。GO功能包括核因子受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性等。KEGG共富集得到6条信号通路，主要为炎性反应、免疫调节、激素抵抗等相关信号通路。结论：湿疹溻渍方中有效活性成分可能通过作IL-6、GASP3、JUN等多个靶点进而调节多条信号通路来起到抑制湿疹炎性反应的作用，研究结果将为进一步研究提供重要信息依据。

关键词 湿疹溻渍方;湿疹;网络药理学;作用机制;富集分析;炎性反应;调控网络;蛋白相互作用

Abstract Objective：To explore the material basis and mechanism of Shizhen Tazi Decoction（SZTZF）in the treatment of eczema using network pharmacology.Methods：The Platform of Pharmacology Technology of traditional Chinese Medicine system（TCMSP）was used in the screening of the active components and action targets of SZTZF.Correspondingly， the targets related to eczema were screened based on GeneCards database.The intersection genes between drug action targets and eczema disease targets were determined based on the analysis of the two clusters of targets， and the regulatory network of SZTZF′s effective component target-eczema disease target was further constructed.Protein interaction network（PPI）model was constructed with STRING platform.At the same time， the genetic ontology（GO）and the Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）pathway analysis were conducted.Results：Through database analysis，66 targets related to 49 main active components of SZTZF and eczema were selected， of which 23 were closely related to eczema.The results of PPI analysis showed that interleukin， cluster differentiation antigen， sex hormone receptor and related tumor proteins occupy the core position in the network.The genetic ontology（GO）functions of TCM-disease targets included nuclear receptor activity， transcription factor activity， steroid hormone receptor activity and so on.By KEGG enrichment analysis， six signal pathways related to the main components of SZTZF were selected， which were mainly related to inflammation， immune regulation， hormone resistance， etc.Conclusion：The effective active ingredients in SZTZF may act as multiple targets such as IL-6， GASP3， and JUN and then regulate multiple signaling pathways to play a role in inhibiting the inflammatory response of eczema.The research results will provide important information for further research.

Keywords Shizhen Tazi Decoction; Eczema; Network pharmacology; Mechanism; Enrichment; Inflammatory reaction; Regulatory network analysis; Protein interaction network

中图分类号：R275.9文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.012

湿疹（Eczema）是一种以皮肤多形损害，有明显渗出倾向为主要特征的过敏性炎性反应性皮肤病[1]。湿疹皮疹多呈对称分布，伴剧烈瘙痒，反復发作，易成慢性，严重影响生命质量。一项基于我国人群的流行病学研究表明，湿疹在我国一般人群患病率约为7.5%[2-3]。在临床治疗中通常将湿疹分为急性湿疹、亚急性湿疹、慢性湿疹[2]。研究表明，多种因素与湿疹的发生密切相关，包括免疫因素、环境因素、遗传因素、感染因素、饮食因素等因素有密切关联[4-5]。在目前临床中多以抗组胺药物、抗过敏药物、糖皮质激素等治疗为主，抗组胺药物、抗过敏药物往往只能达到缓解症状的目的，糖皮质激素虽短期内可迅速控制症状，但长期药物治疗后引发多种不良反应，停药后可能出现皮损恶化，易产生药物依赖性[6]。研究表明，中医治疗湿疹具有不良反应小，多靶点，多层次，且能够根据不同证型进行辨证论治，多项临床研究表明相关中药内服及外用均有良好的疗效。其中，中医外治法能够直接作用于皮损部位，不良反应少的特点，在湿疹的治疗中具有举足轻重的地位[7-9]。

湿疹溻渍方（SZTZF）是导师闫英教授经过长期临床实践并探索总结的治疗湿疹的经验方，由苦参、荆芥、生地榆等8味药组成，具有清热燥湿、祛风止痒、凉血消肿的功效，通过溻渍法作用于皮损处，临床上治疗成人亚急性湿疹以及婴儿湿疹等有切实疗效。前期研究表明，其能够有效改善瘙痒评分，降低血清中相关白细胞介素及γ-干扰素中细胞因子的表达[10]。同时基于动物研究表明，此方能够对化学药物制造的小鼠湿疹模型耳肿胀程度、皮肤病理学及行为学具有良好的改善作用[11]。本文拟通过网络药理学方法对湿疹溻渍方中药物的活性成分、靶蛋白和所涉及的信号通路进行分析，探讨湿疹溻渍方治疗湿疹的潜在作用机制，为进一步的研究提供基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从TCMSP数据库中获取湿疹溻渍方中所含8味中药的化学成分，通GeneCards数据库获得湿疹相关的靶点基因，Cytoscape软件构建有效成分靶点-疾病靶点的网络模型，通过String数据库构建蛋白互作网络，GO与KEGG方法对相关通路进行富集。

1.2 研究方法

1.2.1 湿疹溻渍方（SZTZF）中药物的活性成分的筛选及汇总 通过中药系统药理学数据库TCMSP[12]与分析平台数据库检索湿疹溻渍方中药物成分，以生物利用度（OB）≥50%，药物相似度（DL）≥0.18为筛选标准，筛选其中的有效活性成分。

1.2.2 湿疹疾病的相关靶点及湿疹溻渍方的潜在作用靶点的预测 基于TCMSP平台提取出的湿疹溻渍方中有效活性成分作用的相关基因靶点，通过GeneCards数据库获得湿疹相关的靶点基因，确定湿疹溻渍方中活性成分与湿疹的交集基因。

1.2.3 湿疹溻渍方的调控网络构建 基于上述分析所得的药物有效活性成分与疾病相关基因靶点之间的关联以及靶点预测结果，采用Cytoscape软件构建湿疹溻渍方有效成分靶点-湿疹疾病靶点的网络模型，通过该网络结构揭示湿疹溻渍方治疗湿疹的多成分、多靶点、多个相关细胞信号通路的作用特点。

1.2.4 靶点基因蛋白互作网络构建 将湿疹溻渍方中活性成分对应的基因与湿疹疾病的交集基因基于String数据库构建蛋白互作网络，利用该数据库探索相关基因的文本挖掘、实验证实、共表达证据及基因融合等证据的蛋白互作关系网络，并绘制蛋白互作网络图，探索疾病与药物之间的蛋白互作关系，并基于以上数据筛选出核心靶基因。

1.2.5 GO与KEGG富集分析 基于R软件，使用Bioconductor数据库，并调用DOSE、clusterProfiler、pathview进行GO和KEGG富集，设置阈值P<0.05，获取靶基因参与的信号通路。

2 结果

2.1 湿疹溻渍方中药物有效活性成分筛选汇总 通过TCMSP数据库检索获得湿疹溻渍方中药物成分，通过筛选（OB）≥50%，（DL）≥0.18得出其有效成分共49种，其中苦参25种、荆芥1种、生地榆1种、白鲜皮4种、防风4种、黄柏6种、马齿苋1种、蛇床子7种，包括苦参碱、苦参烯碱、芒柄花素、茴香碱、苦参醇、毛癣菌素、槐定碱、白鲜碱、巴马汀等。具体活性成分的ID、分子式、生物利用度以及类药性。见表1。

2.2 湿疹溻渍方干预湿疹疾病的潜在作用靶点汇总 本研究通过TCMSP数据库中共筛选出PTGS1、PTGS2、CHRM3、SCN5A、HTR3A等与湿疹溻渍方药物活性成分相关的潜在靶点。利用GeneCards数据库筛选与湿疹密切相关的作用靶点，作者以“eczema”为关键词检索GeneCards数据库后获得了2 391个潜在作用靶点。其中有23个靶点与湿疹溻渍方中药物活性成分作用靶点重合，最终确定这23个靶点是湿疹溻渍方治疗湿疹疾病的候选靶点，包括PTGS2、HTR3A、ADRA1B、ADRB2、OPRM1、IL6、SLC6A4、NOS2、ESR1、AR、MAOB、JUN、IL4、RELA、MMP2、CASP3、MYC、ICAM1、CD44、KDR、PGR、KCNH2、NR3C1。

2.3 湿疹溻渍方的调控网络构建 本研究利用Cytoscape 3.7.2构建其治疗湿疹的调控网络，见图1。

2.4 湿疹溻渍方治疗湿疹的功能蛋白互作网络 本研究利用STRING数据库构建的PPI蛋白互作网络如下，见图2。基于各基因连接节点的数目，联系最为紧密的关键基因为IL-6、GASP3、JUN、MYC、PTGS2、IL-4、MMP2、RELA、AR、CD44、ESR1、ICAM1、KDR、NR3C1、PGR等。

2.5 GO功能富集分析 根据图3可知湿疹溻渍方治疗湿疹的效应可能主要是通过干预核因子受体活性、转录因子活性、直接配体调控序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、DNA结合转录激活活性等相关基因靶点实现的。

2.6 KEGG功能富集 KEGG功能富集分析可知，湿疹溻渍方主要是通过干预MAPK信号通路、激素抵抗、抗叶酸性、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等多个细胞信号通路起到治疗湿疹的作用。见图4。

3 讨论

中医认为，湿疹由风邪、湿邪、热邪蕴结于腠理肌表所致，湿热内蕴耗伤阴血[13]，中医古籍称之为“湿疮”“浸淫疮”“绣球风”等。《医宗金鉴·外科心法要诀》中记载湿疮病的病机“由湿热内搏，滞于肤腠，外为风乘，不得宣通”。《诸病源候论·疮候》记载“疮者，由肤腠虚，风湿之气，折乎血气，结聚所生，递递相对，如新生茱萸子。痛痒搔抓成疮，黄汁出，浸淫生长，时搓时剧”。故治以清热燥湿、祛风止痒、凉血消肿之法。《理瀹骈文》“外治之理即内治之理，外治之药即内治之药，所异者法耳”，故中药的内服和外用治疗原则相同[14]。湿疹溻渍方中，苦参和黄柏为君药，均性味苦寒，苦参有清热燥湿、杀虫止痒之功，黄柏清热燥湿、泻火解毒，两者相须为用，加强清热之力。《本草纲目》记载：“苦参、黄柏之苦寒，皆能补肾，盖取其苦燥湿、寒除热也。热生风，湿生虫，故又能治风杀虫”。荆芥、防风、白鲜皮发表祛风、胜湿理血，共为臣药;生地榆、马齿苋清热解毒凉血消肿，蛇床子祛风燥湿杀虫，共为佐使;全方共奏清热燥湿、祛风止痒、凉血消肿之效，以上药物通过外用溻渍法，直达病所。

本研究基于中药系统药理学数据库与分析平台发现湿疹溻渍方含有苦参碱、苦参烯碱、芒柄花素、茴香碱、苦参醇、毛癣菌素、槐定碱、白鲜碱、巴马汀等49种有效成分，上述活性成分在文献中多次相关报道证明其对湿疹有一定的治疗作用[15-17]。基于该平台获取相关药物成分的对应靶点基因共66个，并通过Genecards数据库获得湿疹相关靶点基因2 391个，两者共有23个基因靶点相重合，且彼此之间密切关联。23个重合靶点基因主要与炎性反应、免疫调节、激素抵抗等密切相关。基于PPI网络对所获取基因相关表达蛋白关系进行探究，发现白细胞介素、簇分化抗原、性激素受体及相关肿瘤蛋白在网络中占据核心地位。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能的数据库，该数据库有助于把基因及表达信息作为一个整体的网络进行研究。对所获取的23个重合靶点基因进行GO和KEGG富集发现，其效应可能通过干预核因子受体活性、转录因子活性、直接配体调控序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、DNA结合转录激活活性等相关基因靶点实现的，与P13K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、抗叶酸性、激素抵抗信号通路密切相关。

PI3K/AKT信号通路可调控炎性反应细胞的活化、炎性递质的释放等途径，对慢性炎性反应发挥作用[18]。该信号通路不仅与增殖、凋亡密切相关，同时能够通过调控IκBα的磷酸化、降解，从而激活NF-κB信号通路。NF-κB是一类能与多种基因启动因子发生特异性结合并促进其转录的蛋白质总称，广泛参与多种基因特别是免疫炎性反应相关基因的表达调控，影响炎性反应过程。研究表明，NF-κB通路在湿疹患者皮损角质形成细胞中过度被激活[19]。RELA基因所表达蛋白是炎性反应通路NF-κB的关键因子，在中性粒细胞的凋亡中有重要地位，活化的中性粒细胞能够分泌INF-γ、IL-6等炎性因子，升高TNF-α等趋化因子，加重炎性反应[20]。研究表明，TNF-α及IL-6的表达依赖于MAPK信号通路的激活[21]。综上MAPK信号通路、NF-κB信号通路、P13K-Akt信号通路均为与炎性反应密切相关[22]，湿疹溻渍方可能通过对以上通路的调节作用减轻了湿疹的炎性反应。免疫细胞聚集在炎性反应部位时，处于一个快速缺氧的环境中，进而诱导免疫细胞转录HIF-1α，在细胞内积聚后与HIF-1β结合形成HIF-1，HIF-1与HRE结合，参与多条信号转导通路[23-24]。叶酸可能通过抑制THP-1细胞NF-κB通路的激活及其炎性反应递质的释放，进而缓解低氧引起的细胞炎性反应[25]。此外，临床上部分湿疹患者在规范外用糖皮质激素治疗后，皮损面积及症状好转不明显，存在激素抵抗。湿疹溻渍方可能通过调节激素抵抗相关通路干预此类湿疹患者的治疗。综上所述，这些通路与炎性反应的产生和治疗均有一定关联，同时前期研究表明，湿疹溻渍方能够抑制血清中相关白细胞介素及γ-干扰素等相关细胞因子的表达，在一定程度上印证了此方对湿疹治疗的机制[10-11]。本课题组进将一步通过基础实验对湿疹溻渍方治疗湿疹网络药理学预测相关靶点及通路进行验证，以阐明该方对湿疹治疗的具体机制。

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（2020-03-31收稿 责任编辑：王明）